Penyakit Alzheimer (AD) kekurangan biomarker protein yang mencerminkan pelbagai patofisiologi asasnya, menghalang kemajuan diagnosis dan rawatan. Di sini, kami menggunakan proteomik komprehensif untuk mengenal pasti biomarker cecair serebrospinal (CSF) yang mewakili pelbagai patofisiologi AD. Spektrometri jisim berganda mengenal pasti kira-kira 3,500 dan kira-kira 12,000 protein dalam AD CSF dan otak, masing-masing. Analisis rangkaian proteom otak menyelesaikan 44 modul biodiversiti, 15 daripadanya bertindih dengan proteom cecair serebrospinal. Penanda CSF AD dalam modul bertindih ini dilipat menjadi lima kumpulan protein, mewakili proses patofisiologi yang berbeza. Sinaps dan metabolit dalam otak AD berkurangan, tetapi CSF meningkat, manakala myelinasi yang kaya dengan glial dan kumpulan imun dalam otak dan CSF meningkat. Konsistensi dan kekhususan penyakit perubahan panel telah disahkan dalam lebih daripada 500 sampel CSF tambahan. Kumpulan ini juga mengenal pasti subkumpulan biologi dalam AD tanpa gejala. Secara keseluruhan, keputusan ini merupakan langkah yang menjanjikan ke arah alat biomarker berasaskan web untuk aplikasi klinikal dalam AD.
Penyakit Alzheimer (AD) adalah penyebab paling biasa demensia neurodegeneratif di seluruh dunia dan dicirikan oleh pelbagai disfungsi sistem biologi, termasuk penghantaran sinaptik, imuniti pengantara glial, dan metabolisme mitokondria (1-3). Walau bagaimanapun, biomarker proteinnya yang mantap masih menumpukan pada pengesanan protein amiloid dan tau, dan oleh itu tidak dapat mencerminkan patofisiologi yang pelbagai ini. Biomarker protein "teras" ini yang paling boleh dipercayai diukur dalam cecair serebrospinal (CSF) termasuk (i) amiloid beta peptide 1-42 (Aβ1-42), yang mencerminkan pembentukan plak amiloid kortikal; (ii) jumlah tau, tanda kemerosotan akson; (iii) fosfo-tau (p-tau), wakil hiperfosforilasi tau patologi (4-7). Walaupun biomarker cecair serebrospinal ini telah memudahkan pengesanan kami terhadap penyakit protein AD yang "bertanda" (4-7), ia hanya mewakili sebahagian kecil daripada biologi kompleks di sebalik penyakit ini.
Kekurangan kepelbagaian patofisiologi biomarker AD telah membawa kepada banyak cabaran, termasuk (i) ketidakupayaan untuk mengenal pasti dan mengukur heterogeniti biologi pesakit AD, (ii) pengukuran keparahan dan perkembangan penyakit yang tidak mencukupi, terutamanya dalam peringkat praklinikal, Dan ( iii) pembangunan ubat terapeutik yang gagal menyelesaikan sepenuhnya semua aspek kemerosotan saraf. Kebergantungan kami pada patologi mercu tanda untuk menggambarkan AD daripada penyakit berkaitan hanya memburukkan lagi masalah ini. Semakin banyak bukti menunjukkan bahawa kebanyakan orang tua dengan demensia mempunyai lebih daripada satu ciri patologi penurunan kognitif (8). Sebanyak 90% atau lebih individu dengan patologi AD juga mempunyai penyakit vaskular, kemasukan TDP-43, atau penyakit degeneratif lain (9). Perkadaran pertindihan patologi yang tinggi ini telah mengganggu rangka kerja diagnostik semasa kami untuk demensia, dan definisi patofisiologi penyakit yang lebih komprehensif diperlukan.
Memandangkan keperluan mendesak untuk pelbagai biomarker AD, bidang ini semakin menggunakan kaedah "omics" berdasarkan sistem keseluruhan untuk menemui biomarker. Accelerated Pharmaceutical Partnership (AMP)-AD Alliance telah dilancarkan pada 2014 dan berada di barisan hadapan program. Usaha pelbagai disiplin oleh Institut Kesihatan, akademia dan industri Kebangsaan ini bertujuan untuk menggunakan strategi berasaskan sistem untuk mentakrifkan patofisiologi AD dengan lebih baik dan membangunkan analisis diagnostik dan strategi rawatan biodiversiti (10). Sebagai sebahagian daripada projek ini, proteomik rangkaian telah menjadi alat yang menjanjikan untuk kemajuan biomarker berasaskan sistem dalam AD. Pendekatan dipacu data tidak berat sebelah ini mengatur set data proteomik kompleks ke dalam kumpulan atau "modul" protein yang dinyatakan bersama yang dikaitkan dengan jenis sel, organel dan fungsi biologi tertentu (11-13). Hampir 12 kajian proteomik rangkaian yang kaya dengan maklumat telah dijalankan pada otak AD (13-23). Secara keseluruhan, analisis ini menunjukkan bahawa proteom rangkaian otak AD mengekalkan organisasi modular yang sangat terpelihara dalam kohort bebas dan pelbagai kawasan kortikal. Di samping itu, beberapa modul ini menunjukkan perubahan yang boleh dihasilkan dalam kelimpahan berkaitan AD merentas set data, mencerminkan patofisiologi pelbagai penyakit. Secara kolektif, penemuan ini menunjukkan titik utama yang menjanjikan untuk penemuan proteom rangkaian otak sebagai biomarker berasaskan sistem dalam AD.
Untuk mengubah proteom rangkaian otak AD menjadi biomarker berasaskan sistem yang berguna secara klinikal, kami menggabungkan rangkaian yang berasal dari otak dengan analisis proteomik AD CSF. Pendekatan bersepadu ini membawa kepada pengenalpastian lima set biomarker CSF yang menjanjikan yang dikaitkan dengan pelbagai patofisiologi berasaskan otak, termasuk sinaps, saluran darah, mielinasi, keradangan, dan disfungsi laluan metabolik. Kami berjaya mengesahkan panel biomarker ini melalui pelbagai analisis replikasi, termasuk lebih daripada 500 sampel CSF daripada pelbagai penyakit neurodegeneratif. Analisis pengesahan ini termasuk memeriksa sasaran kumpulan dalam CSF pesakit dengan AD tanpa gejala (AsymAD) atau menunjukkan bukti pengumpulan amiloid yang tidak normal dalam persekitaran kognitif biasa. Analisis ini menyerlahkan heterogeniti biologi yang ketara dalam populasi AsymAD dan mengenal pasti penanda panel yang mungkin dapat menyamakan individu dalam peringkat terawal penyakit ini. Secara keseluruhan, keputusan ini mewakili langkah penting dalam pembangunan alat biomarker protein berdasarkan pelbagai sistem yang berjaya menyelesaikan banyak cabaran klinikal yang dihadapi oleh AD.
Tujuan utama kajian ini adalah untuk mengenal pasti biomarker cecair serebrospinal baru yang mencerminkan pelbagai patofisiologi berasaskan otak yang membawa kepada AD. Rajah S1 menggariskan metodologi penyelidikan kami, yang merangkumi (i) analisis komprehensif yang didorong oleh penemuan awal AD CSF dan proteom otak rangkaian untuk mengenal pasti pelbagai biomarker penyakit CSF yang berkaitan dengan otak, dan (ii) replikasi seterusnya Biomarker ini berada dalam beberapa cerebrospinal bebas. kohort bendalir. Penyelidikan berorientasikan penemuan bermula dengan analisis ekspresi pembezaan CSF dalam 20 individu normal kognitif dan 20 pesakit AD di Pusat Penyelidikan Penyakit Alzheimer (ADRC) Emory Goizueta. Diagnosis AD ditakrifkan sebagai kemerosotan kognitif yang ketara dengan kehadiran Aβ1-42 yang rendah dan tahap peningkatan jumlah tau dan p-tau dalam cecair serebrospinal [Min Montreal Cognitive Assessment (MoCA), 13.8 ± 7.0] [ELISA (ELISA). )]] (Jadual S1A). Kawalan (min MoCA, 26.7 ± 2.2) mempunyai tahap normal biomarker CSF.
CSF manusia dicirikan oleh julat dinamik kelimpahan protein, di mana albumin dan protein lain yang sangat banyak boleh menghalang pengesanan protein yang menarik (24). Untuk meningkatkan kedalaman penemuan protein, kami mengeluarkan 14 protein pertama yang sangat banyak daripada setiap sampel CSF sebelum analisis spektrometri jisim (MS) (24). Sebanyak 39,805 peptida telah dikenal pasti oleh MS, yang dipetakan kepada 3691 proteom dalam 40 sampel. Kuantifikasi protein dilakukan dengan pelabelan tag jisim berbilang tandem (TMT) (18, 25). Untuk menyelesaikan data yang hilang, kami memasukkan hanya protein yang dikira dalam sekurang-kurangnya 50% sampel dalam analisis seterusnya, dengan itu akhirnya mengukur 2875 proteom. Disebabkan perbezaan ketara dalam jumlah tahap kelimpahan protein, sampel kawalan secara statistik dianggap sebagai outlier (13) dan tidak dimasukkan dalam analisis seterusnya. Nilai kelimpahan baki 39 sampel telah diselaraskan mengikut umur, jantina, dan kovarians kelompok (13-15, 17, 18, 20, 26).
Menggunakan analisis ujian-t statistik untuk menilai ungkapan pembezaan pada set data regresi, analisis ini mengenal pasti protein yang tahap kelimpahannya berubah dengan ketara (P <0.05) antara kawalan dan kes AD (Jadual S2A). Seperti yang ditunjukkan dalam Rajah 1A, kelimpahan sejumlah 225 protein dalam AD telah dikurangkan dengan ketara, dan kelimpahan 303 protein meningkat dengan ketara. Protein yang dinyatakan secara berbeza ini termasuk beberapa penanda AD cecair serebrospinal yang dikenal pasti sebelum ini, seperti tau protein berkaitan mikrotubule (MAPT; P = 3.52 × 10−8), neurofilamen (NEFL; P = 6.56 × 10−3), Protein berkaitan pertumbuhan 43 (GAP43; P = 1.46 × 10−5), Protein Pengikat Asid Lemak 3 (FABP3; P = 2.00 × 10−5), Kitinase 3 seperti 1 (CHI3L1; P = 4.44 × 10−6), Granulin Neural (NRGN; P = 3.43 × 10−4) dan faktor pertumbuhan saraf VGF (VGF; P = 4.83 × 10−3) (4-6). Walau bagaimanapun, kami juga mengenal pasti sasaran lain yang sangat penting, seperti perencat pemisahan KDNK 1 (GDI1; P = 1.54 × 10-10) dan pengikatan kalsium modular berkaitan SPARC 1 (SMOC1; P = 6.93 × 10-9) . Analisis Gene Ontologi (GO) terhadap 225 protein yang dikurangkan dengan ketara mendedahkan hubungan rapat dengan proses cecair badan seperti metabolisme steroid, pembekuan darah dan aktiviti hormon (Rajah 1B dan Jadual S2B). Sebaliknya, protein yang meningkat dengan ketara sebanyak 303 berkait rapat dengan struktur sel dan metabolisme tenaga.
(A) Plot gunung berapi menunjukkan perubahan lipatan log2 (paksi-x) berbanding nilai P statistik -log10 (paksi-y) yang diperolehi oleh ujian-t, yang digunakan untuk mengesan ungkapan pembezaan antara kawalan (CT) dan AD kes proteom CSF Daripada semua protein. Protein dengan paras yang berkurangan dengan ketara (P <0.05) dalam AD ditunjukkan dalam warna biru, manakala protein dengan paras penyakit yang meningkat dengan ketara ditunjukkan dalam warna merah. Protein yang dipilih dilabelkan. (B) Istilah GO teratas yang berkaitan dengan protein dikurangkan dengan ketara (biru) dan meningkat (merah) dalam AD. Menunjukkan tiga istilah GO dengan skor z tertinggi dalam bidang proses biologi, fungsi molekul dan komponen selular. (C) MS mengukur tahap MAPT dalam sampel CSF (kiri) dan korelasinya dengan sampel ELISA tau tahap (kanan). Pekali korelasi Pearson dengan nilai P yang berkaitan dipaparkan. Oleh kerana kekurangan data ELISA untuk satu kes AD, angka ini termasuk nilai untuk 38 daripada 39 kes yang dianalisis. (D) Analisis kelompok yang diselia (P <0.0001, Benjamini-Hochberg (BH) diselaraskan P <0.01) pada kawalan dan AD CSF mendapati sampel menggunakan 65 protein yang paling ketara berubah dalam set data. Seragamkan, normalkan.
Tahap proteomik MAPT berkait rapat dengan tahap ELISA tau yang diukur secara bebas (r = 0.78, P = 7.8 × 10-9; Rajah 1C), menyokong kesahihan pengukuran MS kami. Selepas pencernaan trypsin pada tahap protein prekursor amiloid (APP), peptida khusus isoform yang dipetakan ke terminal C Aβ1-40 dan Aβ1-42 tidak dapat diionkan dengan cekap (27, 28). Oleh itu, peptida APP yang kami kenal pasti tidak ada kaitan dengan tahap ELISA Aβ1-42. Untuk menilai ungkapan pembezaan setiap kes, kami menggunakan protein yang dinyatakan secara berbeza dengan P <0.0001 [kadar penemuan palsu (FDR) diperbetulkan P <0.01] untuk melakukan analisis kluster yang diselia bagi sampel (Jadual S2A). Seperti yang ditunjukkan dalam Rajah 1D, 65 protein yang sangat penting ini boleh mengelompokkan sampel dengan betul mengikut keadaan penyakit, kecuali untuk satu kes AD dengan ciri seperti kawalan. Daripada 65 protein ini, 63 meningkat pada AD, manakala hanya dua (CD74 dan ISLR) menurun. Secara keseluruhan, analisis cecair serebrospinal ini telah mengenal pasti beratus-ratus protein dalam AD yang mungkin berfungsi sebagai biomarker penyakit.
Kemudian kami melakukan analisis rangkaian bebas proteom otak AD. Kohort otak penemuan ini termasuk korteks prefrontal dorsolateral (DLPFC) daripada kawalan (n = 10), penyakit Parkinson (PD; n = 10), kes AD/PD campuran (n = 10) dan AD (n = 10). ) Sampel. Emery Goizueta ADRC. Demografi 40 kes ini telah diterangkan sebelum ini (25) dan diringkaskan dalam Jadual S1B. Kami menggunakan TMT-MS untuk menganalisis 40 tisu otak ini dan kohort replikasi 27 kes. Secara keseluruhan, kedua-dua set data otak ini menghasilkan 227, 121 peptida unik, yang dipetakan kepada 12, 943 proteom (25). Hanya protein yang dikira dalam sekurang-kurangnya 50% kes dimasukkan dalam penyiasatan berikutnya. Set data penemuan akhir mengandungi 8817 protein terkuantifikasi. Laraskan tahap kelimpahan protein berdasarkan umur, jantina dan selang post-mortem (PMI). Analisis ungkapan pembezaan set data selepas regresi menunjukkan bahawa> 2000 tahap protein telah berubah dengan ketara [P <0.05, analisis varians (ANOVA)] dalam dua atau lebih kohort penyakit. Kemudian, kami melakukan analisis kluster yang diselia berdasarkan protein yang dinyatakan secara berbeza, dan P <0.0001 dalam perbandingan AD / kawalan dan / atau AD / PD (Rajah S2, A dan B, Jadual S2C). 165 protein yang sangat diubah ini dengan jelas menggambarkan kes dengan patologi AD daripada sampel kawalan dan PD, mengesahkan perubahan khusus AD yang kuat dalam keseluruhan proteom.
Kami kemudiannya menggunakan algoritma yang dipanggil Weighted Gene Co-expression Network Analysis (WGCNA) untuk melakukan analisis rangkaian pada proteom otak yang ditemui, yang menyusun set data ke dalam modul protein dengan corak ekspresi yang serupa (11-13). Analisis mengenal pasti 44 modul (M) protein yang dinyatakan bersama, disusun dan dinomborkan daripada yang terbesar (M1, n = 1821 protein) kepada yang terkecil (M44, n = 34 protein) (Rajah 2A dan Jadual S2D) ). Seperti yang dinyatakan di atas (13) Kira profil ekspresi perwakilan atau protein ciri setiap modul, dan kaitkan dengan keadaan penyakit dan patologi AD, iaitu, wujudkan pakatan Pendaftaran Penyakit Alzheimer (CERAD) dan Skor Braak (Rajah 2B). Secara keseluruhan, 17 modul berkaitan dengan neuropatologi AD (P <0.05). Kebanyakan modul berkaitan penyakit ini juga kaya dengan penanda khusus jenis sel (Rajah 2B). Seperti yang dinyatakan di atas (13), pengayaan jenis sel ditentukan dengan menganalisis pertindihan modul dan senarai rujukan gen khusus jenis sel. Gen ini diperoleh daripada data yang diterbitkan dalam neuron tetikus terpencil, sel endothelial dan glial. Percubaan penjujukan RNA (RNA-seq) (29).
(A) Temui WGCNA proteom otak. (B) Analisis korelasi pertengahan biweight (BiCor) protein tandatangan modular (komponen utama pertama ekspresi protein modular) dengan ciri neuropatologi AD (atas), termasuk skor CERAD (Plak Aβ) dan Braak (tau kusut). Keamatan korelasi positif (merah) dan negatif (biru) ditunjukkan oleh peta haba dua warna, dan asterisk menunjukkan kepentingan statistik (P <0.05). Gunakan Hypergeometric Fisher's Exact Test (FET) (bawah) untuk menilai perkaitan jenis sel setiap modul protein. Keamatan teduhan merah menunjukkan tahap pengayaan jenis sel, dan asterisk menunjukkan kepentingan statistik (P <0.05). Gunakan kaedah BH untuk membetulkan nilai P yang diperoleh daripada FET. (C) Analisis GO protein modular. Proses biologi yang paling rapat ditunjukkan untuk setiap modul atau kumpulan modul yang berkaitan. oligo, oligodendrocyte.
Satu set lima modul astrocyte dan mikroglia yang berkait rapat (M30, M29, M18, M24, dan M5) menunjukkan korelasi positif yang kuat dengan neuropatologi AD (Rajah 2B). Analisis ontologi menghubungkan modul glial ini dengan pertumbuhan sel, percambahan dan imuniti (Rajah 2C dan Jadual S2E). Dua modul glial tambahan, M8 dan M22, juga dikawal dengan kuat dalam penyakit. M8 sangat berkaitan dengan laluan reseptor seperti Tol, lata isyarat yang memainkan peranan penting dalam tindak balas imun semula jadi (30). Pada masa yang sama, M22 berkait rapat dengan pengubahsuaian pasca terjemahan. M2, yang kaya dengan oligodendrocytes, menunjukkan korelasi positif yang kuat dengan patologi AD dan sambungan ontologi dengan sintesis nukleosida dan replikasi DNA, menunjukkan peningkatan percambahan sel dalam penyakit. Secara keseluruhan, penemuan ini menyokong ketinggian modul glial yang telah kita perhatikan sebelum ini dalam proteom rangkaian AD (13, 17). Pada masa ini didapati bahawa banyak modul glial berkaitan AD dalam rangkaian menunjukkan tahap ekspresi yang lebih rendah dalam kawalan dan kes PD, menonjolkan kekhususan penyakit mereka yang dinaikkan dalam AD (Rajah S2C).
Hanya empat modul dalam proteom rangkaian kami (M1, M3, M10, dan M32) sangat berkorelasi negatif dengan patologi AD (P <0.05) (Rajah 2, B dan C). Kedua-dua M1 dan M3 kaya dengan penanda neuron. M1 sangat berkaitan dengan isyarat sinaptik, manakala M3 berkait rapat dengan fungsi mitokondria. Tiada bukti pengayaan jenis sel untuk M10 dan M32. M32 mencerminkan hubungan antara M3 dan metabolisme sel, manakala M10 sangat berkaitan dengan pertumbuhan sel dan fungsi mikrotubulus. Berbanding dengan AD, keempat-empat modul ditingkatkan dalam kawalan dan PD, memberikan mereka perubahan AD khusus penyakit (Rajah S2C). Secara keseluruhannya, keputusan ini menyokong penurunan jumlah modul kaya neuron yang telah kita perhatikan sebelum ini dalam AD (13, 17). Ringkasnya, analisis rangkaian proteom otak yang kami temui menghasilkan modul AD yang diubah secara khusus selaras dengan penemuan kami sebelum ini.
AD dicirikan oleh peringkat asimtomatik awal (AsymAD), di mana individu mempamerkan pengumpulan amiloid tanpa penurunan kognitif klinikal (5, 31). Peringkat tanpa gejala ini mewakili tetingkap kritikal untuk pengesanan awal dan campur tangan. Kami sebelum ini telah menunjukkan pemeliharaan modular kuat AsymAD dan proteom rangkaian otak AD merentas set data bebas (13, 17). Untuk memastikan bahawa rangkaian otak yang kami temui pada masa ini adalah konsisten dengan penemuan sebelumnya ini, kami menganalisis pemeliharaan 44 modul dalam set data yang direplikasi daripada 27 organisasi DLPFC. Organisasi ini termasuk kes kawalan (n = 10), AsymAD (n = 8 ) Dan AD (n = 9). Sampel kawalan dan AD dimasukkan dalam analisis kohort otak penemuan kami (Jadual S1B), manakala kes AsymAD hanya unik dalam kohort replikasi. Kes AsymAD ini juga datang dari bank otak Emory Goizueta ADRC. Walaupun kognisi adalah normal pada masa kematian, tahap amiloid adalah luar biasa tinggi (min CERAD, 2.8 ± 0.5) (Jadual S1B).
Analisis TMT-MS terhadap 27 tisu otak ini menghasilkan kuantifikasi 11,244 proteom. Kiraan akhir ini termasuk hanya protein yang dikira dalam sekurang-kurangnya 50% daripada sampel. Set data yang direplikasi ini mengandungi 8638 (98.0%) daripada 8817 protein yang dikesan dalam analisis otak penemuan kami, dan mempunyai hampir 3000 protein yang berubah dengan ketara antara kawalan dan kohort AD (P <0.05, selepas ujian t berpasangan Tukey untuk analisis varians) ( Jadual S2F). Di antara protein yang dinyatakan secara berbeza ini, 910 juga menunjukkan perubahan tahap yang ketara antara AD dan kes kawalan proteom otak (P <0.05, selepas ujian-t pasangan ANOVA Tukey). Perlu diingat bahawa 910 penanda ini sangat konsisten dalam arah perubahan antara proteom (r = 0.94, P <1.0 × 10-200) (Rajah S3A). Di antara protein yang meningkat, protein dengan perubahan paling konsisten antara set data adalah terutamanya ahli modul M5 dan M18 yang kaya dengan glial (MDK, COL25A1, MAPT, NTN1, SMOC1, dan GFAP). Di antara protein yang dikurangkan, mereka yang mempunyai perubahan yang paling konsisten adalah hampir secara eksklusif ahli modul M1 (NPTX2, VGF, dan RPH3A) yang dikaitkan dengan sinaps. Kami selanjutnya mengesahkan perubahan midkine (MDK) yang berkaitan dengan AD, CD44, protein berkaitan frizzled 1 (SFRP1) dan VGF yang dirembeskan oleh western blotting (Rajah S3B). Analisis pemeliharaan modul menunjukkan bahawa kira-kira 80% daripada modul protein (34/44) dalam proteom otak telah dipelihara dengan ketara dalam set data replikasi (z-skor> 1.96, FDR diperbetulkan P <0.05) (Rajah S3C). Empat belas daripada modul ini dikhaskan di antara dua proteom (z-skor> 10, FDR diperbetulkan P <1.0 × 10-23). Secara keseluruhannya, penemuan dan replikasi tahap konsistensi yang tinggi dalam ekspresi pembezaan dan komposisi modular antara proteom otak menyerlahkan kebolehulangan perubahan dalam protein korteks hadapan AD. Di samping itu, ia juga mengesahkan bahawa AsymAD dan penyakit yang lebih maju mempunyai struktur rangkaian otak yang hampir sama.
Analisis yang lebih terperinci mengenai ekspresi pembezaan dalam set data replikasi otak menyerlahkan tahap ketara perubahan protein AsymAD, termasuk sejumlah 151 protein yang berubah dengan ketara antara AsymAD dan kawalan (P <0.05) (Rajah S3D). Selaras dengan beban amiloid, APP dalam otak AsymAD dan AD meningkat dengan ketara. MAPT hanya berubah dengan ketara dalam AD, yang konsisten dengan peningkatan tahap kusut dan korelasi yang diketahui dengan penurunan kognitif (5, 7). Modul yang kaya dengan glial (M5 dan M18) sangat dicerminkan dalam peningkatan protein dalam AsymAD, manakala modul M1 yang berkaitan dengan neuron adalah yang paling mewakili penurunan protein dalam AsymAD. Kebanyakan penanda AsymAD ini menunjukkan perubahan yang lebih besar dalam penyakit simptomatik. Antara penanda ini ialah SMOC1, protein glial kepunyaan M18, yang dikaitkan dengan tumor otak dan perkembangan mata dan anggota badan (32). MDK ialah faktor pertumbuhan pengikat heparin yang berkaitan dengan pertumbuhan sel dan angiogenesis (33), ahli lain M18. Berbanding dengan kumpulan kawalan, AsymAD meningkat dengan ketara, diikuti dengan peningkatan yang lebih besar dalam AD. Sebaliknya, protein sinaptik neuropentraxin 2 (NPTX2) telah dikurangkan dengan ketara dalam otak AsymAD. NPTX2 sebelum ini dikaitkan dengan neurodegeneration dan mempunyai peranan yang diiktiraf dalam mengantar sinaps rangsangan (34). Secara keseluruhan, keputusan ini mendedahkan pelbagai perubahan protein praklinikal yang berbeza dalam AD yang nampaknya berkembang dengan keterukan penyakit.
Memandangkan kami telah mencapai kedalaman liputan protein yang ketara dalam penemuan proteom otak, kami cuba memahami lebih lengkap pertindihannya dengan transkriptom AD peringkat rangkaian. Oleh itu, kami membandingkan proteom otak yang kami temui dengan modul yang kami hasilkan sebelum ini daripada pengukuran microarray sebanyak 18, 204 gen dalam AD (n = 308) dan kawalan (n = 157) tisu DLPFC (13). bertindih. Secara keseluruhan, kami mengenal pasti 20 modul RNA yang berbeza, kebanyakannya menunjukkan pengayaan jenis sel tertentu, termasuk neuron, oligodendrocytes, astrocytes, dan microglia (Rajah 3A). Pelbagai perubahan modul ini dalam AD ditunjukkan dalam Rajah 3B. Selaras dengan analisis pertindihan protein-RNA kami sebelum ini menggunakan proteom MS yang tidak berlabel yang lebih mendalam (kira-kira 3000 protein) (13), kebanyakan daripada 44 modul dalam rangkaian proteom otak yang kami temui berada dalam rangkaian transkriptom Tidak terdapat pertindihan yang ketara. Malah dalam penemuan dan replikasi 34 modul protein yang sangat dikekalkan dalam proteom otak, hanya 14 (~40%) yang lulus ujian tepat Fisher (FET) terbukti mempunyai pertindihan yang ketara secara statistik dengan transkrip (Rajah 3A). Serasi dengan pembaikan kerosakan DNA (P-M25 dan P-M19), terjemahan protein (P-M7 dan P-M20), pengikatan/penyambungan RNA (P-M16 dan P-M21) dan penyasaran protein (P-M13 dan P- M23) tidak bertindih dengan modul dalam transkrip. Oleh itu, walaupun set data proteom yang lebih mendalam digunakan dalam analisis pertindihan semasa (13), kebanyakan proteom rangkaian AD tidak dipetakan ke rangkaian transkrip.
(A) FET hipergeometrik menunjukkan pengayaan penanda khusus jenis sel dalam modul RNA transkriptom AD (atas) dan tahap pertindihan antara modul RNA (paksi-x) dan protein (paksi-y) otak AD (bawah). Keamatan teduhan merah menunjukkan tahap pengayaan jenis sel di panel atas dan keamatan pertindihan modul di panel bawah. Asterisk menunjukkan kepentingan statistik (P <0.05). (B) Tahap korelasi antara gen ciri setiap modul transkrip dan status AD. Modul di sebelah kiri adalah yang paling berkorelasi negatif dengan AD (biru), dan modul di sebelah kanan adalah yang paling positif berkorelasi dengan AD (merah). Nilai P pembetulan BH yang diubah log menunjukkan tahap kepentingan statistik bagi setiap korelasi. (C) Modul bertindih yang ketara dengan pengayaan jenis sel kongsi. (D) Analisis korelasi perubahan log2 lipatan protein berlabel (paksi-x) dan RNA (paksi-y) dalam modul bertindih. Pekali korelasi Pearson dengan nilai P yang berkaitan dipaparkan. Mikro, mikroglia; badan angkasa, astrosit. CT, kawalan.
Kebanyakan modul protein dan RNA yang bertindih berkongsi profil pengayaan jenis sel yang serupa dan arah perubahan AD yang konsisten (Rajah 3, B dan C). Dalam erti kata lain, modul M1 berkaitan sinaps proteom otak (PM1) dipetakan kepada tiga modul RNA homologus yang kaya dengan neuron (R-M1, R-M9 dan R-M16), yang terdapat dalam AD Kedua-duanya menunjukkan tahap yang dikurangkan. Begitu juga, modul protein M5 dan M18 yang kaya dengan glial bertindih dengan modul RNA yang kaya dengan astrocytes dan penanda mikroglial (R-M3, R-M7, dan R-M10) dan sangat terlibat dalam peningkatan penyakit. Ciri modular yang dikongsi ini antara kedua-dua set data menyokong lagi pengayaan jenis sel dan perubahan berkaitan penyakit yang telah kami perhatikan dalam proteom otak. Walau bagaimanapun, kami melihat banyak perbezaan yang ketara antara tahap RNA dan protein penanda individu dalam modul yang dikongsi ini. Analisis korelasi bagi ekspresi pembezaan proteomik dan transkriptomi molekul dalam modul bertindih ini (Rajah 3D) menyerlahkan ketidakkonsistenan ini. Sebagai contoh, APP dan beberapa protein modul glial lain (NTN1, MDK, COL25A1, ICAM1, dan SFRP1) menunjukkan peningkatan ketara dalam proteom AD, tetapi hampir tiada perubahan dalam transkriptom AD. Perubahan khusus protein ini mungkin berkait rapat dengan plak amiloid (23, 35), menonjolkan proteom sebagai sumber perubahan patologi, dan perubahan ini mungkin tidak dapat dilihat dalam transkrip.
Selepas menganalisis secara bebas otak dan proteom CSF yang kami temui, kami menjalankan analisis komprehensif kedua-dua set data untuk mengenal pasti biomarker AD CSF yang berkaitan dengan patofisiologi rangkaian otak. Kita mesti terlebih dahulu menentukan pertindihan kedua-dua proteom. Walaupun diterima secara meluas bahawa CSF mencerminkan perubahan neurokimia dalam otak AD (4), tahap pertindihan yang tepat antara otak AD dan proteom CSF tidak jelas. Dengan membandingkan bilangan produk gen kongsi yang dikesan dalam dua proteom kami, kami mendapati bahawa hampir 70% (n = 1936) daripada protein yang dikenal pasti dalam cecair serebrospinal juga dikira dalam otak (Rajah 4A). Kebanyakan protein bertindih ini (n = 1721) dipetakan kepada salah satu daripada 44 modul ekspresi bersama daripada set data otak penemuan (Rajah 4B). Seperti yang dijangkakan, enam modul otak terbesar (M1 hingga M6) mempamerkan jumlah pertindihan CSF yang paling banyak. Walau bagaimanapun, terdapat modul otak yang lebih kecil (contohnya, M15 dan M29) yang mencapai tahap pertindihan tinggi yang tidak dijangka, lebih besar daripada modul otak dua kali ganda saiznya. Ini mendorong kami untuk menggunakan kaedah yang lebih terperinci, didorong secara statistik untuk mengira pertindihan antara otak dan cecair serebrospinal.
(A dan B) Protein yang dikesan dalam otak penemuan dan set data CSF bertindih. Kebanyakan protein bertindih ini dikaitkan dengan salah satu daripada 44 modul ekspresi bersama rangkaian ekspresi bersama otak. (C) Temui pertindihan antara proteom cecair serebrospinal dan proteom rangkaian otak. Setiap baris peta haba mewakili analisis pertindihan berasingan bagi FET hipergeometrik. Baris atas menggambarkan pertindihan (lorek kelabu/hitam) antara modul otak dan keseluruhan proteom CSF. Baris kedua menggambarkan bahawa pertindihan antara modul otak dan protein CSF (berwarna merah) dikawal dengan ketara dalam AD (P <0.05). Baris ketiga menunjukkan bahawa pertindihan antara modul otak dan protein CSF (teduhan biru) dikawal dengan ketara dalam AD (P <0.05). Gunakan kaedah BH untuk membetulkan nilai P yang diperoleh daripada FET. (D) Panel modul lipat berdasarkan perkaitan jenis sel dan istilah GO yang berkaitan. Panel ini mengandungi sejumlah 271 protein berkaitan otak, yang mempunyai ekspresi pembezaan yang bermakna dalam proteom CSF.
Menggunakan FET ekor tunggal, kami menilai kepentingan pertindihan protein antara proteom CSF dan modul otak individu. Analisis mendedahkan bahawa sejumlah 14 modul otak dalam set data CSF mempunyai pertindihan yang ketara secara statistik (FDR diselaraskan P <0.05), dan modul tambahan (M18) yang pertindihannya hampir kepada kepentingan (FDR diselaraskan P = 0.06) (Rajah 4C , baris atas). Kami juga berminat dengan modul yang sangat bertindih dengan protein CSF yang dinyatakan secara berbeza. Oleh itu, kami menggunakan dua analisis FET tambahan untuk menentukan mana antara (i) protein CSF meningkat dengan ketara dalam AD dan (ii) protein CSF telah menurun dengan ketara dalam AD (P <0.05, ujian t berpasangan AD/kawalan) Modul otak dengan pertindihan yang bermakna antara mereka. Seperti yang ditunjukkan dalam baris tengah dan bawah Rajah 4C, analisis tambahan ini menunjukkan bahawa 8 daripada 44 modul otak bertindih dengan ketara dengan protein yang ditambahkan dalam AD CSF (M12, M1, M2, M18, M5, M44, M33, dan M38) . ), manakala hanya dua modul (M6 dan M15) menunjukkan pertindihan yang bermakna dengan protein yang dikurangkan dalam AD CSF. Seperti yang dijangkakan, kesemua 10 modul berada dalam 15 modul dengan pertindihan tertinggi dengan proteom CSF. Oleh itu, kami menganggap bahawa 15 modul ini adalah sumber hasil tinggi bagi biomarker CSF yang berasal dari otak AD.
Kami melipat 15 modul bertindih ini ke dalam lima panel protein besar berdasarkan kedekatannya dalam rajah pokok WGCNA dan perkaitannya dengan jenis sel dan ontologi gen (Rajah 4D). Panel pertama mengandungi modul yang kaya dengan penanda neuron dan protein berkaitan sinaps (M1 dan M12). Panel sinaptik mengandungi sejumlah 94 protein, dan tahap dalam proteom CSF telah berubah dengan ketara, menjadikannya sumber terbesar penanda CSF berkaitan otak antara lima panel. Kumpulan kedua (M6 dan M15) menunjukkan hubungan rapat dengan penanda sel endothelial dan badan vaskular, seperti "penyembuhan luka" (M6) dan "peraturan tindak balas imun humoral" (M15). M15 juga sangat berkaitan dengan metabolisme lipoprotein, yang berkait rapat dengan endothelium (36). Panel vaskular mengandungi 34 penanda CSF yang berkaitan dengan otak. Kumpulan ketiga termasuk modul (M2 dan M4) yang sangat berkaitan dengan penanda oligodendrocyte dan percambahan sel. Sebagai contoh, istilah ontologi peringkat atas M2 termasuk "peraturan positif replikasi DNA" dan "proses biosintesis purin". Sementara itu, M4 termasuk "pembezaan sel glial" dan "pemisahan kromosom". Panel mielin mengandungi 49 penanda CSF yang berkaitan dengan otak.
Kumpulan keempat mengandungi paling banyak modul (M30, M29, M18, M24, dan M5), dan hampir semua modul kaya dengan mikroglia dan penanda astrocyte. Sama seperti panel mielin, panel keempat juga mengandungi modul (M30, M29, dan M18) yang berkait rapat dengan percambahan sel. Modul lain dalam kumpulan ini sangat berkaitan dengan istilah imunologi, seperti "proses kesan imun" (M5) dan "peraturan tindak balas imun" (M24). Kumpulan imun glial mengandungi 42 penanda CSF yang berkaitan dengan otak. Akhir sekali, panel terakhir termasuk 52 penanda berkaitan otak pada empat modul (M44, M3, M33, dan M38), yang semuanya berada pada badan yang berkaitan dengan penyimpanan tenaga dan metabolisme. Modul terbesar (M3) ini berkait rapat dengan mitokondria dan kaya dengan penanda khusus neuron. M38 adalah salah satu ahli modul yang lebih kecil dalam metabolom ini dan juga mempamerkan kekhususan neuron sederhana.
Secara keseluruhan, lima panel ini mencerminkan pelbagai jenis dan fungsi sel dalam korteks AD, dan secara kolektif mengandungi 271 penanda CSF berkaitan otak (Jadual S2G). Untuk menilai kesahihan keputusan MS ini, kami menggunakan ujian sambungan jarak dekat (PEA), teknologi berasaskan antibodi ortogon dengan keupayaan pemultipleksan, kepekaan dan kekhususan yang tinggi, dan menganalisis semula sampel cecair serebrospinal yang kami temui Subset daripada 271 biomarker ini. (n = 36). 36 sasaran ini menunjukkan perubahan dalam gandaan AD PEA, yang berkait rapat dengan penemuan berasaskan MS kami (r = 0.87, P = 5.6 × 10-12), Yang mengesahkan keputusan analisis MS komprehensif kami (Rajah S4). ).
Tema biologi yang ditekankan oleh lima kumpulan kami, daripada isyarat sinaptik kepada metabolisme tenaga, semuanya berkaitan dengan patogenesis AD (1-3). Oleh itu, kesemua 15 modul yang mengandungi panel ini berkaitan dengan patologi AD dalam proteom otak yang kami temui (Rajah 2B). Yang paling ketara ialah korelasi patologi positif yang tinggi antara modul glial kami dan korelasi patologi negatif yang kuat antara modul neuron terbesar kami (M1 dan M3). Analisis ekspresi pembezaan proteom otak kami yang direplikasi (Rajah S3D) juga menyerlahkan protein glial yang berasal dari M5 dan M18. Dalam AsymAD dan AD bergejala, protein glial yang paling banyak meningkat dan sinaps berkaitan M1 Protein dikurangkan paling banyak. Pemerhatian ini menunjukkan bahawa 271 penanda cecair serebrospinal yang kami kenal pasti dalam lima kumpulan adalah berkaitan dengan proses penyakit dalam korteks AD, termasuk yang berlaku pada peringkat awal tanpa gejala.
Untuk menganalisis dengan lebih baik arah perubahan protein panel dalam otak dan cecair tulang belakang, kami melukis perkara berikut untuk setiap 15 modul bertindih: (i) menemui tahap kelimpahan modul dalam set data otak dan (ii) modul protein Perbezaannya dinyatakan dalam cecair serebrospinal (Rajah S5). Seperti yang dinyatakan sebelum ini, WGCNA digunakan untuk menentukan kelimpahan modul atau nilai protein ciri dalam otak (13). Peta gunung berapi digunakan untuk menerangkan ekspresi pembezaan protein modular dalam cecair serebrospinal (AD/kawalan). Angka-angka ini menunjukkan bahawa tiga daripada lima panel menunjukkan trend ekspresi yang berbeza dalam otak dan cecair tulang belakang. Kedua-dua modul panel sinaps (M1 dan M12) menunjukkan penurunan dalam tahap kelimpahan dalam otak AD, tetapi bertindih dengan ketara dengan peningkatan protein dalam AD CSF (Rajah S5A). Modul berkaitan neuron yang mengandungi metabolom (M3 dan M38) menunjukkan pola ekspresi cecair otak dan serebrospinal yang serupa tidak konsisten (Rajah S5E). Panel vaskular juga menunjukkan trend ekspresi yang berbeza, walaupun modulnya (M6 dan M15) meningkat secara sederhana dalam otak AD dan menurun dalam CSF yang berpenyakit (Rajah S5B). Baki dua panel mengandungi rangkaian glial besar yang proteinnya dikawal secara konsisten dalam kedua-dua petak (Rajah S5, C dan D).
Sila ambil perhatian bahawa aliran ini tidak biasa kepada semua penanda dalam panel ini. Sebagai contoh, panel sinaptik termasuk beberapa protein yang dikurangkan dengan ketara dalam otak AD dan CSF (Rajah S5A). Antara penanda cecair serebrospinal terkawal bawah ini ialah NPTX2 dan VGF M1, dan kromogranin B M12. Walau bagaimanapun, walaupun terdapat pengecualian ini, kebanyakan penanda sinaptik kami dinaikkan dalam cecair tulang belakang AD. Secara keseluruhan, analisis ini dapat membezakan trend statistik yang signifikan dalam otak dan paras cecair serebrospinal dalam setiap lima panel kami. Trend ini menyerlahkan hubungan yang kompleks dan sering berbeza antara otak dan ekspresi protein CSF dalam AD.
Kemudian, kami menggunakan analisis replikasi MS berkeupayaan tinggi (replikasi CSF 1) untuk menyempitkan 271 set biomarker kami kepada sasaran yang paling menjanjikan dan boleh dihasilkan semula (Rajah 5A). Salinan CSF 1 mengandungi sejumlah 96 sampel daripada Emory Goizueta ADRC, termasuk kawalan, AsymAD dan kohort AD (Jadual S1A). Kes AD ini dicirikan oleh penurunan kognitif ringan (min MoCA, 20.0 ± 3.8), dan perubahan dalam biomarker AD yang disahkan dalam cecair serebrospinal (Jadual S1A). Bertentangan dengan analisis CSF yang kami temui, replikasi ini dilakukan menggunakan kaedah MS "tembakan tunggal" yang lebih cekap dan tinggi (tanpa pecahan luar talian), termasuk protokol penyediaan sampel yang dipermudahkan yang menghapuskan keperluan untuk kekurangan imun bagi sampel individu. . Sebaliknya, satu "saluran peningkatan" yang berkurangan imun digunakan untuk menguatkan isyarat protein yang kurang banyak (37). Walaupun ia mengurangkan jumlah liputan proteom, kaedah satu pukulan ini dengan ketara mengurangkan masa mesin dan meningkatkan bilangan sampel berlabel TMT yang boleh dianalisis berdaya maju (17, 38). Secara keseluruhan, analisis mengenal pasti 6, 487 peptida, yang dipetakan kepada 1, 183 proteom dalam 96 kes. Seperti analisis CSF yang kami dapati, hanya protein yang dikira dalam sekurang-kurangnya 50% daripada sampel dimasukkan ke dalam pengiraan seterusnya, dan data telah diregres untuk kesan umur dan jantina. Ini membawa kepada kuantifikasi akhir 792 proteom, 95% daripadanya turut dikenal pasti dalam set data CSF yang ditemui.
(A) Sasaran protein CSF berkaitan otak disahkan dalam kohort CSF yang direplikasi pertama dan dimasukkan dalam panel akhir (n = 60). (B hingga E) Tahap biomarker panel (skor z komposit) diukur dalam empat kohort replikasi CSF. Ujian-t berpasangan atau ANOVA dengan pembetulan pasca Tukey digunakan untuk menilai kepentingan statistik perubahan kelimpahan dalam setiap analisis replika. CT, kawalan.
Oleh kerana kami amat berminat untuk mengesahkan 271 sasaran CSF berkaitan otak kami melalui analisis komprehensif, kami akan mengehadkan pemeriksaan lanjut terhadap proteom yang direplikasi ini kepada penanda ini. Di antara 271 protein ini, 100 telah dikesan dalam replikasi CSF 1. Rajah S6A menunjukkan ungkapan pembezaan 100 penanda bertindih ini antara kawalan dan sampel replikasi AD. Histon sinaptik dan metabolit meningkat paling banyak dalam AD, manakala protein vaskular berkurangan paling banyak dalam penyakit. Kebanyakan daripada 100 penanda bertindih (n = 70) mengekalkan arah perubahan yang sama dalam dua set data (Rajah S6B). 70 penanda CSF berkaitan otak yang disahkan (Jadual S2H) ini sebahagian besarnya mencerminkan trend ekspresi panel yang diperhatikan sebelum ini, iaitu, pengawalan ke bawah protein vaskular dan pengawalan atas semua panel lain. Hanya 10 daripada 70 protein yang disahkan ini menunjukkan perubahan dalam kelimpahan AD yang bercanggah dengan trend panel ini. Untuk menghasilkan panel yang paling mencerminkan trend keseluruhan otak dan cecair serebrospinal, kami mengecualikan 10 protein ini daripada panel minat yang akhirnya kami sahkan (Rajah 5A). Oleh itu, panel kami akhirnya merangkumi sejumlah 60 protein yang disahkan dalam dua kohort AD CSF bebas menggunakan penyediaan sampel yang berbeza dan analisis platform MS. Plot ekspresi z-skor panel akhir ini dalam kawalan salinan 1 CSF dan kes AD mengesahkan trend panel yang diperhatikan dalam kohort CSF yang kami temui (Rajah 5B).
Di antara 60 protein ini, terdapat molekul yang diketahui dikaitkan dengan AD, seperti osteopontin (SPP1), yang merupakan sitokin pro-radang yang telah dikaitkan dengan AD dalam banyak kajian (39-41), dan GAP43, Protein sinaptik. yang jelas dikaitkan dengan neurodegeneration (42). Protein yang paling disahkan sepenuhnya ialah penanda yang berkaitan dengan penyakit neurodegeneratif lain, seperti amyotrophic lateral sclerosis (ALS) superoxide dismutase 1 (SOD1) yang berkaitan dengan penyakit Parkinson dan desaccharase berkaitan penyakit Parkinson (PARK7). Kami juga telah mengesahkan bahawa banyak penanda lain, seperti SMOC1 dan protein isyarat lampiran membran kaya otak 1 (BASP1), telah mengehadkan pautan sebelumnya kepada neurodegenerasi. Perlu diingat bahawa disebabkan kelimpahan keseluruhannya yang rendah dalam proteom CSF, adalah sukar bagi kita untuk menggunakan kaedah pengesanan satu tangkapan berdaya tinggi ini untuk mengesan MAPT dan protein berkaitan AD tertentu yang lain (contohnya, NEFL dan NRGN) dengan pasti. ) ( 43, 44).
Kami kemudian menyemak 60 penanda panel keutamaan ini dalam tiga analisis replika tambahan. Dalam CSF Copy 2, kami menggunakan TMT-MS tunggal untuk menganalisis kohort bebas 297 kawalan dan sampel AD daripada Emory Goizueta ADRC (17). Replikasi CSF 3 termasuk analisis semula data TMT-MS yang tersedia daripada 120 kawalan dan pesakit AD dari Lausanne, Switzerland (45). Kami mengesan lebih daripada dua pertiga daripada 60 penanda keutamaan dalam setiap set data. Walaupun kajian Switzerland menggunakan platform MS yang berbeza dan kaedah kuantifikasi TMT (45, 46), kami mengeluarkan semula trend panel kami dengan kuat dalam dua analisis berulang (Rajah 5, C dan D, dan Jadual S2, I, dan J). Untuk menilai kekhususan penyakit kumpulan kami, kami menggunakan TMT-MS untuk menganalisis set data replikasi keempat (replikasi CSF 4), yang termasuk bukan sahaja kawalan (n = 18) dan AD (n = 17) kes, tetapi juga PD ( n = 14)), sampel ALS (n = 18) dan demensia frontotemporal (FTD) (n = 11) (Jadual S1A). Kami berjaya mengukur hampir dua pertiga daripada protein panel dalam kohort ini (38 daripada 60). Keputusan ini menyerlahkan perubahan khusus AD dalam kesemua lima panel biomarker (Rajah 5E dan Jadual S2K). Peningkatan dalam kumpulan metabolit menunjukkan kekhususan AD yang paling kuat, diikuti oleh kumpulan mielinasi dan glial. Pada tahap yang lebih rendah, FTD juga menunjukkan peningkatan antara panel ini, yang mungkin mencerminkan potensi perubahan rangkaian yang serupa (17). Sebaliknya, ALS dan PD menunjukkan hampir sama profil myelination, glial, dan metabolom sebagai kumpulan kawalan. Secara keseluruhan, walaupun terdapat perbezaan dalam penyediaan sampel, platform MS dan kaedah kuantifikasi TMT, analisis berulang ini menunjukkan bahawa penanda panel keutamaan kami mempunyai perubahan khusus AD yang sangat konsisten dalam lebih daripada 500 sampel CSF unik.
Neurodegenerasi AD telah diiktiraf secara meluas beberapa tahun sebelum permulaan gejala kognitif, jadi terdapat keperluan mendesak untuk biomarker AsymAD (5, 31). Walau bagaimanapun, semakin banyak bukti menunjukkan bahawa biologi AsymAD jauh dari homogen, dan interaksi kompleks risiko dan daya tahan membawa kepada perbezaan individu yang besar dalam perkembangan penyakit berikutnya (47). Walaupun digunakan untuk mengenal pasti kes AsymAD, tahap biomarker CSF teras (Aβ1-42, jumlah tau dan p-tau) tidak terbukti dapat meramalkan dengan pasti siapa yang akan berkembang menjadi demensia (4, 7), menunjukkan lebih banyak. perlu memasukkan alat biomarker holistik berdasarkan pelbagai aspek fisiologi otak untuk menyusun secara tepat risiko populasi ini. Oleh itu, kami kemudiannya menganalisis panel biomarker yang disahkan AD kami dalam populasi AsymAD salinan CSF 1. 31 kes AsymAD ini menunjukkan tahap biomarker teras yang tidak normal (Aβ1–42/jumlah nisbah ELISA tau, <5.5) dan kognisi lengkap (min MoCA, 27.1 ± 2.2) (Jadual S1A). Di samping itu, semua individu dengan AsymAD mempunyai skor demensia klinikal 0, menunjukkan bahawa tiada bukti penurunan dalam prestasi kognitif atau fungsian harian.
Kami mula-mula menganalisis tahap panel yang disahkan dalam semua 96 replika CSF 1, termasuk kohort AsymAD. Kami mendapati bahawa beberapa panel dalam kumpulan AsymAD mempunyai perubahan kelimpahan seperti AD yang ketara, panel vaskular menunjukkan trend menurun dalam AsymAD, manakala semua panel lain menunjukkan trend menaik (Rajah 6A). Oleh itu, semua panel menunjukkan korelasi yang sangat ketara dengan ELISA Aβ1-42 dan jumlah tahap tau (Rajah 6B). Sebaliknya, korelasi antara kumpulan dan skor MoCA adalah agak lemah. Salah satu penemuan yang lebih menarik daripada analisis ini ialah julat besar kelimpahan panel dalam kohort AsymAD. Seperti yang ditunjukkan dalam Rajah 6A, tahap panel kumpulan AsymAD biasanya melintasi tahap panel kumpulan kawalan dan kumpulan AD, menunjukkan kebolehubahan yang agak tinggi. Untuk meneroka lebih lanjut heterogeniti AsymAD ini, kami menggunakan analisis Multidimensional Scaling (MDS) kepada 96 replikasi CSF 1 kes. Analisis MDS membolehkan untuk menggambarkan persamaan antara kes berdasarkan pembolehubah tertentu dalam set data. Untuk analisis kelompok ini, kami hanya menggunakan penanda panel yang disahkan yang mempunyai perubahan ketara secara statistik (P <0.05, AD/kawalan) dalam tahap penemuan CSF dan replikasi 1 proteom (n = 29) (Jadual S2L). Analisis ini menghasilkan kluster spatial yang jelas antara kawalan kami dan kes AD (Rajah 6C). Sebaliknya, beberapa kes AsymAD jelas terkumpul dalam kumpulan kawalan, manakala yang lain terletak dalam kes AD. Untuk meneroka lebih lanjut heterogeniti AsymAD ini, kami menggunakan peta MDS kami untuk menentukan dua kumpulan kes AsymAD ini. Kumpulan pertama termasuk kes AsymAD berkelompok lebih dekat dengan kawalan (n = 19), manakala kumpulan kedua dicirikan oleh kes AsymAD dengan profil penanda lebih dekat dengan AD (n = 12).
(A) Tahap ekspresi (z-skor) kumpulan biomarker CSF dalam semua 96 sampel dalam kohort replikasi CSF 1, termasuk AsymAD. Analisis varians dengan pembetulan pasca Tukey digunakan untuk menilai kepentingan statistik perubahan kelimpahan panel. (B) Analisis korelasi tahap kelimpahan protein panel (z-skor) dengan skor MoCA dan jumlah tahap tau dalam sampel ELISA Aβ1-42 dan CSF salinan 1. Pekali korelasi Pearson dengan nilai P yang berkaitan dipaparkan. (C) MDS bagi 96 kes salinan CSF 1 adalah berdasarkan tahap kelimpahan 29 penanda panel yang disahkan, yang telah berubah dengan ketara dalam kedua-dua set data penemuan dan salinan CSF 1 [P <0.05 AD/kawalan (CT)]. Analisis ini digunakan untuk membahagikan kumpulan AsymAD kepada subkumpulan kawalan (n = 19) dan AD (n = 12). (D) Plot gunung berapi menunjukkan ekspresi pembezaan semua protein replikasi 1 CSF dengan perubahan lipatan log2 (paksi-x) berbanding nilai P statistik -log10 antara dua subkumpulan AsymAD. Biomarker panel berwarna. (E) Replikasi CSF 1 tahap kelimpahan biomarker kumpulan pemilihan dinyatakan secara berbeza antara subkumpulan AsymAD. Analisis varians pasca pelarasan Tukey digunakan untuk menilai kepentingan statistik.
Kami mengkaji ungkapan protein pembezaan antara kawalan ini dan kes AsymAD seperti AD (Rajah 6D dan Jadual S2L). Peta gunung berapi yang terhasil menunjukkan bahawa 14 penanda panel telah berubah dengan ketara antara kedua-dua kumpulan. Kebanyakan penanda ini adalah ahli sinaps dan metabolom. Walau bagaimanapun, substrat kinase C protein kinase C yang kaya dengan alanine (MARCKS) SOD1 dan myristoylated, yang merupakan ahli kumpulan imun myelin dan glial, juga tergolong dalam kumpulan ini (Rajah 6, D dan E). Panel vaskular juga menyumbang dua penanda yang dikurangkan dengan ketara dalam kumpulan AsymAD seperti AD, termasuk protein pengikat AE 1 (AEBP1) dan melengkapkan ahli keluarga C9. Tidak terdapat perbezaan yang signifikan antara kawalan dan subkumpulan AsymAD seperti AD dalam ELISA AB1-42 (P = 0.38) dan p-tau (P = 0.28), tetapi sememangnya terdapat perbezaan yang signifikan dalam jumlah tahap tau (P = 0.0031). ) (Gamb. S7). Terdapat beberapa penanda panel yang menunjukkan bahawa perubahan antara dua subkumpulan AsymAD adalah lebih ketara daripada jumlah tahap tau (contohnya, YWHAZ, SOD1 dan MDH1) (Rajah 6E). Secara keseluruhannya, keputusan ini menunjukkan bahawa panel kami yang disahkan mungkin mengandungi biomarker yang boleh subtipe dan potensi stratifikasi risiko pesakit dengan penyakit tanpa gejala.
Terdapat keperluan mendesak untuk alat biomarker berasaskan sistem untuk mengukur dan menyasarkan pelbagai patofisiologi di belakang AD dengan lebih baik. Alat ini dijangka bukan sahaja mengubah rangka kerja diagnostik AD kami, tetapi juga menggalakkan penggunaan strategi rawatan khusus pesakit yang berkesan (1, 2). Untuk tujuan ini, kami menggunakan pendekatan proteomik komprehensif yang tidak berat sebelah kepada otak AD dan CSF untuk mengenal pasti biomarker CSF berasaskan web yang mencerminkan pelbagai patofisiologi berasaskan otak. Analisis kami menghasilkan lima panel biomarker CSF, yang (i) mencerminkan sinaps, saluran darah, myelin, imun dan disfungsi metabolik; (ii) menunjukkan kebolehulangan yang kuat pada platform MS yang berbeza; (iii) Tunjukkan perubahan khusus penyakit yang progresif sepanjang peringkat awal dan akhir AD. Secara keseluruhan, penemuan ini mewakili satu langkah yang menjanjikan ke arah pembangunan alat biomarker berorientasikan web yang pelbagai, boleh dipercayai, untuk penyelidikan AD dan aplikasi klinikal.
Keputusan kami menunjukkan organisasi proteom rangkaian otak AD yang sangat terpelihara dan menyokong penggunaannya sebagai sauh untuk pembangunan biomarker berasaskan sistem. Analisis kami menunjukkan bahawa dua set data TMT-MS bebas yang mengandungi otak AD dan AsymAD mempunyai modulariti yang kuat. Penemuan ini memanjangkan kerja kami sebelum ini, menunjukkan pemeliharaan modul berkuasa lebih daripada 2,000 tisu otak daripada pelbagai kohort bebas dalam korteks frontal, parietal, dan temporal (17). Rangkaian konsensus ini mencerminkan pelbagai perubahan berkaitan penyakit yang diperhatikan dalam penyelidikan semasa, termasuk peningkatan modul keradangan yang kaya dengan glial dan penurunan modul yang kaya dengan neuron. Seperti penyelidikan semasa, rangkaian berskala besar ini juga menampilkan perubahan modular yang ketara dalam AsymAD, menunjukkan pelbagai patofisiologi praklinikal yang berbeza (17).
Walau bagaimanapun, dalam rangka kerja berasaskan sistem yang sangat konservatif ini, terdapat heterogeniti biologi yang lebih halus, terutamanya di kalangan individu pada peringkat awal AD. Panel biomarker kami dapat menggambarkan dua subkumpulan dalam AsymAD, yang menunjukkan ekspresi pembezaan yang ketara bagi pelbagai penanda CSF. Kumpulan kami dapat menyerlahkan perbezaan biologi antara kedua-dua subkumpulan ini, yang tidak jelas pada tahap biomarker teras AD. Berbanding dengan kumpulan kawalan, nisbah Aβ1-42/jumlah tau individu AsymAD ini adalah sangat rendah. Walau bagaimanapun, hanya jumlah tahap tau berbeza dengan ketara antara kedua-dua subkumpulan AsymAD, manakala tahap Aβ1-42 dan p-tau kekal secara relatifnya setanding. Memandangkan tau CSF yang tinggi nampaknya merupakan peramal yang lebih baik bagi simptom kognitif daripada tahap Aβ1-42 (7), kami mengesyaki bahawa kedua-dua kohort AsymAD mungkin mempunyai risiko yang berbeza untuk perkembangan penyakit. Memandangkan saiz sampel terhad AsymAD kami dan kekurangan data membujur, penyelidikan lanjut diperlukan untuk membuat kesimpulan ini dengan yakin. Walau bagaimanapun, keputusan ini menunjukkan bahawa panel CSF berasaskan sistem boleh meningkatkan keupayaan kami untuk menyusun secara berkesan individu semasa peringkat asimtomatik penyakit ini.
Secara keseluruhannya, penemuan kami menyokong peranan pelbagai fungsi biologi dalam patogenesis AD. Walau bagaimanapun, metabolisme tenaga yang tidak terkawal menjadi tema yang menonjol bagi kesemua lima panel pelabelan kami yang disahkan. Protein metabolik, seperti hypoxanthine-guanine phosphoribosyltransferase 1 (HPRT1) dan lactate dehydrogenase A (LDHA), adalah biomarker sinaptik yang paling teguh disahkan, menunjukkan bahawa peningkatan AD CSF adalah jantina yang boleh dihasilkan semula. Salur darah dan panel glial kami juga mengandungi beberapa penanda yang terlibat dalam metabolisme bahan oksidatif. Penemuan ini konsisten dengan peranan utama yang dimainkan oleh proses metabolik di seluruh otak, bukan sahaja untuk memenuhi permintaan tenaga yang tinggi bagi neuron, tetapi juga untuk memenuhi permintaan tenaga yang tinggi bagi astrosit dan sel glial lain (17, 48). Keputusan kami menyokong bukti yang semakin meningkat bahawa perubahan dalam potensi redoks dan gangguan laluan tenaga mungkin merupakan hubungan teras antara beberapa proses utama yang terlibat dalam patogenesis AD, termasuk gangguan mitokondria, keradangan glial-mediated, dan kerosakan Vaskular (49). Di samping itu, biomarker cecair serebrospinal metabolik mengandungi sejumlah besar protein kaya yang berbeza antara kawalan kami dan subkumpulan AsymAD seperti AD, menunjukkan bahawa gangguan laluan tenaga dan redoks ini mungkin kritikal dalam peringkat praklinikal penyakit ini.
Trend panel cecair otak dan cerebrospinal yang berbeza yang telah kami perhatikan juga mempunyai implikasi biologi yang menarik. Sinaps dan metabolom yang kaya dengan neuron menunjukkan penurunan tahap dalam otak AD dan peningkatan kelimpahan dalam cecair serebrospinal. Memandangkan neuron kaya dengan mitokondria yang menghasilkan tenaga pada sinaps untuk membekalkan tenaga bagi banyak isyarat khusus mereka (50), persamaan profil ekspresi kedua-dua kumpulan neuron ini dijangka. Kehilangan neuron dan penyemperitan sel yang rosak boleh menjelaskan trend panel otak dan CSF ini dalam penyakit kemudian, tetapi mereka tidak dapat menjelaskan perubahan panel awal yang kita perhatikan (13). Satu penjelasan yang mungkin untuk penemuan ini dalam penyakit asimtomatik awal adalah pemangkasan sinaptik yang tidak normal. Bukti baru dalam model tetikus menunjukkan bahawa fagositosis sinaptik yang dimediasi mikroglia mungkin diaktifkan secara tidak normal dalam AD dan membawa kepada kehilangan sinaps awal di otak (51). Bahan sinaptik yang dibuang ini mungkin terkumpul dalam CSF, itulah sebabnya kami memerhatikan peningkatan dalam CSF dalam panel neuron. Pemangkasan sinaptik pengantara imun juga mungkin menjelaskan sebahagian peningkatan protein glial yang kita perhatikan dalam otak dan cecair serebrospinal sepanjang proses penyakit. Sebagai tambahan kepada pemangkasan sinaptik, keabnormalan keseluruhan dalam laluan eksositik juga boleh membawa kepada ekspresi otak dan CSF yang berbeza bagi penanda neuron. Beberapa kajian telah menunjukkan bahawa kandungan eksosom dalam patogenesis otak AD telah berubah (52). Laluan ekstraselular juga terlibat dalam percambahan Aβ (53, 54). Perlu diingat bahawa penindasan rembesan eksosomal boleh mengurangkan patologi seperti AD dalam model tetikus transgenik AD (55).
Pada masa yang sama, protein dalam panel vaskular menunjukkan peningkatan sederhana dalam otak AD, tetapi menurun dengan ketara dalam CSF. Disfungsi penghalang darah-otak (BBB) boleh menjelaskan sebahagian penemuan ini. Banyak kajian postmortem manusia bebas telah menunjukkan pecahan BBB dalam AD (56, 57). Kajian ini mengesahkan pelbagai aktiviti abnormal yang mengelilingi lapisan sel endothelial yang tertutup rapat ini, termasuk kebocoran kapilari otak dan pengumpulan perivaskular protein bawaan darah (57). Ini boleh memberikan penjelasan mudah untuk protein vaskular yang tinggi di dalam otak, tetapi ia tidak dapat menjelaskan sepenuhnya kekurangan protein yang sama ini dalam cecair serebrospinal. Satu kemungkinan ialah sistem saraf pusat secara aktif mengasingkan molekul ini untuk menyelesaikan masalah peningkatan keradangan dan tekanan oksidatif. Pengurangan dalam beberapa protein CSF yang paling teruk dalam panel ini, terutamanya yang terlibat dalam pengawalan lipoprotein, adalah berkaitan dengan perencatan tahap keradangan yang berbahaya dan proses neuroprotektif spesies oksigen reaktif. Ini benar untuk Paroxonase 1 (PON1), enzim pengikat lipoprotein yang bertanggungjawab untuk mengurangkan tahap tekanan oksidatif dalam peredaran (58, 59). Alpha-1-microglobulin/bikunin prekursor (AMBP) adalah satu lagi penanda yang dikawal dengan ketara bagi kumpulan vaskular. Ia adalah prekursor bikunin pengangkut lipid, yang juga terlibat dalam penindasan keradangan dan Perlindungan neurologi (60, 61).
Walaupun terdapat pelbagai hipotesis yang menarik, ketidakupayaan untuk mengesan secara langsung mekanisme penyakit biokimia adalah batasan yang terkenal dalam analisis proteomik yang didorong oleh penemuan. Oleh itu, penyelidikan lanjut diperlukan untuk menentukan mekanisme di sebalik panel biomarker ini dengan yakin. Untuk bergerak ke arah pembangunan analisis klinikal berasaskan MS, hala tuju masa depan juga memerlukan penggunaan kaedah kuantitatif yang disasarkan untuk pengesahan biomarker berskala besar, seperti pemantauan tindak balas terpilih atau selari (62). Kami baru-baru ini menggunakan pemantauan tindak balas selari (63) untuk mengesahkan banyak perubahan protein CSF yang diterangkan di sini. Beberapa sasaran panel keutamaan dikira dengan ketepatan yang ketara, termasuk YWHAZ, ALDOA, dan SMOC1, yang masing-masing memetakan ke sinaps, metabolisme dan panel keradangan kami (63). Pemerolehan Data Bebas (DIA) dan strategi berasaskan MS lain juga mungkin berguna untuk pengesahan sasaran. Bud et al. (64) Baru-baru ini telah ditunjukkan bahawa terdapat pertindihan yang ketara antara biomarker AD yang dikenal pasti dalam set data penemuan CSF kami dan set data DIA-MS bebas, yang terdiri daripada hampir 200 sampel CSF daripada tiga kohort Eropah yang berbeza . Kajian terbaru ini menyokong potensi panel kami untuk berubah menjadi pengesanan berasaskan MS yang boleh dipercayai. Pengesanan berasaskan antibodi dan aptamer tradisional juga penting untuk pembangunan selanjutnya biomarker AD utama. Oleh kerana kelimpahan CSF yang rendah, adalah lebih sukar untuk mengesan biomarker ini menggunakan kaedah MS throughput tinggi. NEFL dan NRGN adalah dua contoh biomarker CSF berkelimpahan rendah, yang dipetakan ke panel dalam analisis komprehensif kami, tetapi tidak boleh dikesan dengan pasti menggunakan strategi MS tunggal kami. Strategi penyasaran berdasarkan pelbagai antibodi, seperti PEA, boleh menggalakkan transformasi klinikal penanda ini.
Secara keseluruhan, kajian ini menyediakan pendekatan proteomik yang unik untuk pengenalpastian dan pengesahan biomarker CSF AD berdasarkan sistem yang berbeza. Mengoptimumkan panel penanda ini merentas kohort AD tambahan dan platform MS mungkin terbukti menjanjikan untuk memajukan stratifikasi dan rawatan risiko AD. Kajian yang menilai tahap longitudinal panel ini dari semasa ke semasa juga penting untuk menentukan gabungan penanda yang paling sesuai menyusun risiko penyakit awal dan perubahan dalam keterukan penyakit.
Kecuali untuk 3 sampel yang disalin oleh CSF, semua sampel CSF yang digunakan dalam kajian ini dikumpulkan di bawah naungan Emory ADRC atau institusi penyelidikan yang berkait rapat. Sebanyak empat set sampel Emory CSF telah digunakan dalam kajian proteomik ini. Kohort CSF didapati mengandungi sampel daripada 20 kawalan sihat dan 20 pesakit AD. Salinan CSF 1 termasuk sampel daripada 32 kawalan sihat, 31 individu AsymAD dan 33 individu AD. Salinan CSF 2 mengandungi 147 kawalan dan 150 sampel AD. Kohort replikasi CSF 4 pelbagai penyakit termasuk 18 kawalan, 17 AD, 19 ALS, 13 PD dan 11 sampel FTD. Menurut perjanjian yang diluluskan oleh Lembaga Kajian Institusi Universiti Emory, semua peserta kajian Emory memperoleh persetujuan termaklum. Menurut Garis Panduan Amalan Terbaik Institut Penuaan Kebangsaan 2014 untuk Pusat Alzheimer (https://alz.washington.edu/BiospecimenTaskForce.html), cecair serebrospinal dikumpulkan dan disimpan melalui tusukan lumbar. Pesakit Kawalan dan AsymAD dan AD menerima penilaian kognitif piawai di Klinik Neurologi Kognitif Emory atau Goizueta ADRC. Sampel cecair serebrospinal mereka telah diuji oleh INNO-BIA AlzBio3 Luminex untuk analisis ELISA Aβ1-42, jumlah tau dan p-tau (65). Nilai ELISA digunakan untuk menyokong klasifikasi diagnostik subjek berdasarkan kriteria pemotongan biomarker AD yang ditetapkan (66, 67). Data demografi dan diagnostik asas untuk diagnosis CSF lain (FTD, ALS dan PD) juga diperoleh daripada Emory ADRC atau institusi penyelidikan gabungan. Metadata kes ringkasan untuk kes Emory CSF ini boleh didapati dalam Jadual S1A. Ciri-ciri kohort Swiss CSF replikasi 3 telah diterbitkan sebelum ini (45).
CSF menemui sampel. Untuk meningkatkan kedalaman penemuan set data CSF kami, penggunaan imun protein kelimpahan tinggi dilakukan sebelum trypsinization. Ringkasnya, 130 μl CSF daripada 40 sampel CSF individu dan jumlah yang sama (130 μl) High Select Top14 Abundance Protein Depletion Resin (Thermo Fisher Scientific, A36372) diletakkan dalam lajur putaran (Thermo Fisher Scientific, A89868) di bilik. suhu Inkubasi). Selepas berputar selama 15 minit, sentrifuge sampel pada 1000g selama 2 minit. Peranti penapis ultracentrifugal 3K (Millipore, UFC500396) digunakan untuk menumpukan sampel efluen dengan mengempar pada 14,000g selama 30 minit. Cairkan semua isipadu sampel kepada 75 μl dengan garam penimbal fosfat. Kepekatan protein dinilai dengan kaedah asid bicinchoninic (BCA) mengikut protokol pengeluar (Thermo Fisher Scientific). CSF immunodepleted (60 μl) daripada semua 40 sampel telah dicerna dengan lysyl endopeptidase (LysC) dan trypsin. Secara ringkasnya, sampel dikurangkan dan dialkilasi dengan 1.2 μl 0.5 M tris-2(-carboxyethyl)-phosphine dan 3 μl 0.8 M chloroacetamide pada 90°C selama 10 minit, dan kemudian disonikasi dalam mandi air selama 15 minit. Sampel telah dicairkan dengan penimbal urea 193 μl 8 M [8 M urea dan 100 mM NaHPO4 (pH 8.5)] kepada kepekatan akhir 6 M urea. LysC (4.5 μg; Wako) digunakan untuk pencernaan semalaman pada suhu bilik. Sampel kemudiannya dicairkan kepada 1 M urea dengan 50 mM ammonium bikarbonat (ABC) (68). Tambah jumlah yang sama (4.5 μg) trypsin (Promega), dan kemudian mengeram sampel selama 12 jam. Asidkan larutan peptida yang dicerna kepada kepekatan akhir 1% asid formik (FA) dan 0.1% asid trifluoroacetic (TFA) (66), dan kemudian nyah garam dengan lajur Sep-Pak C18 50 mg (Waters) seperti yang diterangkan di atas (25) . Peptida kemudiannya dicairkan dalam 1 ml 50% asetonitril (ACN). Untuk menyeragamkan kuantifikasi protein merentas kelompok (25), 100 μl aliquot daripada kesemua 40 sampel CSF telah digabungkan untuk menghasilkan sampel campuran, yang kemudiannya dibahagikan kepada lima sampel standard dalaman global (GIS) (48). Semua sampel individu dan piawaian gabungan dikeringkan dengan vakum berkelajuan tinggi (Labconco).
CSF menyalin sampel. Dayon dan rakan sekerja sebelum ini telah menerangkan pengurangan imun dan pencernaan sampel salinan 3 CSF (45, 46). Sampel replika yang selebihnya tidak immunodepleted secara individu. Hadam sampel yang tidak dialihkan ini dalam trypsin seperti yang diterangkan sebelum ini (17). Untuk setiap analisis berulang, 120 μl aliquot peptida yang dielusi daripada setiap sampel dikumpulkan bersama dan dibahagikan kepada aliquot volum yang sama untuk digunakan sebagai standard dalaman global berlabel TMT (48). Semua sampel individu dan piawaian gabungan dikeringkan dengan vakum berkelajuan tinggi (Labconco). Untuk meningkatkan isyarat protein CSF kelimpahan rendah, dengan menggabungkan 125 μl daripada setiap sampel, sampel "dipertingkatkan" disediakan untuk setiap analisis replika [iaitu, sampel biologi yang meniru sampel penyelidikan, tetapi jumlah yang tersedia adalah jauh lebih besar (37, 69)] digabungkan menjadi sampel CSF bercampur (17). Sampel campuran kemudiannya dialihkan secara imun menggunakan 12 ml High Select Top14 Abundance Protein Resin Resin (Thermo Fisher Scientific, A36372), dicerna seperti yang diterangkan di atas, dan dimasukkan dalam pelabelan TMT berbilang berikutnya.
Masa siaran: 27 Ogos 2021