Terima kasih kerana melawat Nature.com. Versi penyemak imbas yang anda gunakan mempunyai sokongan CSS yang terhad. Untuk pengalaman terbaik, kami mengesyorkan agar anda menggunakan penyemak imbas yang dikemas kini (atau lumpuhkan Mod Keserasian dalam Internet Explorer). Sementara itu, untuk memastikan sokongan berterusan, kami akan menjadikan tapak tanpa gaya dan JavaScript.
Thermophiles ialah mikroorganisma yang hidup subur pada suhu tinggi. Mempelajarinya boleh memberikan maklumat berharga tentang cara hidup menyesuaikan diri dengan keadaan yang melampau. Walau bagaimanapun, sukar untuk mencapai keadaan suhu tinggi dengan mikroskop optik konvensional. Beberapa penyelesaian buatan sendiri berdasarkan pemanasan elektrik perintang tempatan telah dicadangkan, tetapi tiada penyelesaian komersial yang mudah. Dalam makalah ini, kami memperkenalkan konsep pemanasan laser skala mikro pada bidang pandangan mikroskop untuk menyediakan suhu tinggi untuk kajian termofil sambil mengekalkan persekitaran pengguna yang sederhana. Pemanasan skala mikro pada intensiti laser sederhana boleh dicapai menggunakan substrat bersalut nanopartikel emas sebagai penyerap cahaya yang biokompatibel dan cekap. Kesan yang mungkin dari perolakan cecair skala mikro, pengekalan sel, dan gerakan termoforetik emparan dibincangkan. Kaedah ini telah ditunjukkan dalam dua spesies: (i) Geobacillus stearothermophilus, bakteria termofilik aktif yang membiak pada kira-kira 65°C, yang telah kita perhatikan untuk bercambah, tumbuh dan berenang di bawah pemanasan skala mikro; (ii) Thiobacillus sp., arkea hipertermofilik yang optimum. pada 80°C. Kerja ini membuka jalan untuk pemerhatian mudah dan selamat mikroorganisma termofilik menggunakan alat mikroskop moden dan berpatutan.
Selama berbilion tahun, kehidupan di Bumi telah berkembang untuk menyesuaikan diri dengan pelbagai keadaan persekitaran yang kadangkala dianggap melampau dari perspektif manusia kita. Khususnya, beberapa mikroorganisma termofilik (bakteria, archaea, kulat) yang dipanggil termofil hidup subur dalam julat suhu dari 45°C hingga 122°C1, 2, 3, 4. Termofil hidup dalam pelbagai ekosistem, seperti lubang hidroterma laut dalam, mata air panas atau kawasan gunung berapi. Penyelidikan mereka telah menjana banyak minat sejak beberapa dekad yang lalu untuk sekurang-kurangnya dua sebab. Mula-mula, kita boleh belajar daripada mereka, contohnya, bagaimana termofil 5, 6, enzim 7, 8 dan membran 9 stabil pada suhu setinggi itu, atau bagaimana termofil boleh menahan tahap sinaran yang melampau10. Kedua, ia adalah asas bagi banyak aplikasi bioteknologi penting1,11,12 seperti pengeluaran bahan api13,14,15,16, sintesis kimia (dihidro, alkohol, metana, asid amino, dll.)17, biomining18 dan biomangkin termostabil7 ,11, 13. Khususnya, tindak balas rantai polimerase (PCR)19 yang terkenal pada masa ini melibatkan enzim (Taq polymerase) yang diasingkan daripada bakteria termofilik Thermus aquaticus, salah satu daripada termofil pertama yang ditemui.
Walau bagaimanapun, kajian thermophiles bukanlah satu tugas yang mudah dan tidak boleh dibuat improvisasi di mana-mana makmal biologi. Khususnya, termofil hidup tidak boleh diperhatikan secara in vitro dengan mana-mana mikroskop cahaya standard, walaupun dengan ruang pemanas yang tersedia secara komersial, biasanya dinilai untuk suhu serendah 40°C. Sejak tahun 1990-an, hanya beberapa kumpulan penyelidik yang mendedikasikan diri mereka kepada pengenalan sistem mikroskopi suhu tinggi (HTM). Pada tahun 1994 Glukh et al. Kebuk pemanasan/penyejukan diilhamkan berdasarkan penggunaan sel Peltier yang mengawal suhu kapilari segi empat tepat tertutup untuk mengekalkan anaerobik 20 . Peranti ini boleh dipanaskan sehingga 100 °C pada kadar 2 °C/s, membolehkan pengarang mengkaji motilitas bakteria hyperthermophilic Thermotoga maritima21. Pada tahun 1999 Horn et al. Peranti yang hampir serupa telah dibangunkan, masih berdasarkan penggunaan kapilari yang dipanaskan sesuai untuk mikroskop komersial untuk mengkaji pembahagian/sambungan sel. Selepas tempoh yang lama tidak aktif secara relatif, pencarian untuk HTM yang berkesan disambung semula pada tahun 2012, khususnya berkaitan dengan satu siri kertas kerja oleh kumpulan Wirth yang menggunakan peranti yang dicipta oleh Horn et al. Lima belas tahun yang lalu, motilitas sebilangan besar archaea, termasuk hyperthermophiles, telah dikaji pada suhu sehingga 100°C menggunakan kapilari yang dipanaskan23,24. Mereka juga mengubah suai mikroskop asal untuk mencapai pemanasan yang lebih cepat (beberapa minit dan bukannya 35 minit untuk mencapai suhu yang ditetapkan) dan mencapai kecerunan suhu linear lebih daripada 2 cm merentasi medium. Peranti pembentuk kecerunan suhu (TGFD) ini telah digunakan untuk mengkaji mobiliti banyak termofil dalam kecerunan suhu pada jarak yang berkaitan secara biologi 24, 25 .
Pemanasan kapilari tertutup bukan satu-satunya cara untuk memerhatikan termofil hidup. Pada tahun 2012, Kuwabara et al. Ruang Pyrex pakai buang buatan sendiri yang dimeterai dengan pelekat tahan haba (Super X2; Cemedine, Jepun) telah digunakan. Sampel diletakkan pada plat pemanas lutsinar yang tersedia secara komersial (Plat Haba Mikro, Kitazato Corporation, Jepun) yang mampu memanaskan sehingga 110°C, tetapi pada asalnya tidak bertujuan untuk pengimejan bio. Penulis memerhatikan pembahagian bakteria termofilik anaerobik yang cekap (Thermosipho globiformans, masa penggandaan 24 minit) pada 65°C. Pada tahun 2020, Pulshen et al. Pemanasan yang cekap bagi hidangan logam komersial (AttofluorTM, Thermofisher) ditunjukkan menggunakan dua elemen pemanas buatan sendiri: penutup dan pentas (konfigurasi yang diilhamkan oleh mesin PCR). Perkaitan ini menghasilkan suhu cecair yang seragam dan menghalang penyejatan dan pemeluwapan di bahagian bawah tudung. Penggunaan cincin-O mengelakkan pertukaran gas dengan persekitaran. HTM ini, dipanggil Sulfoscope, digunakan untuk imej Sulfolobus acidocaldarius pada 75°C27.
Had yang diiktiraf bagi semua sistem ini ialah sekatan terhadap penggunaan objektif udara, sebarang rendaman minyak tidak sesuai untuk suhu tinggi sedemikian dan untuk pengimejan melalui sampel lutsinar setebal >1 mm. Had yang diiktiraf bagi semua sistem ini ialah sekatan terhadap penggunaan objektif udara, sebarang rendaman minyak tidak sesuai untuk suhu tinggi sedemikian dan untuk pengimejan melalui sampel lutsinar setebal >1 mm. Общепризнанным недостатком всех этих систем было ограничение на использование воздушных объективов, посколюмбужов, посколмьбужов ение в масло не подходило для такой высокой температуры и для визуализации через прозрачные образцы толщ1инмой. Kelemahan yang diiktiraf bagi semua sistem ini ialah had penggunaan objektif udara, kerana sebarang rendaman minyak tidak sesuai untuk suhu yang begitu tinggi dan untuk visualisasi melalui sampel lutsinar > 1 mm tebal.所有这些系统的一个公认限制是限制使用空气物镜，任何油浸都不适合高样的1 合高样厚的透明样品成像。 Had yang diiktiraf bagi semua sistem ini ialah had penggunaan cermin bersalut udara, kerana sebarang rendaman minyak tidak sesuai untuk pengimejan sampel lutsinar >1 mm tebal pada suhu setinggi itu. Общепризнанным недостатком всех этих систем является ограниченное использование воздушных объективов, лимибовов масло непригодно для таких высоких температур и визуализации через прозрачные образцы толщиной >1 мм. Kelemahan yang diiktiraf bagi semua sistem ini ialah penggunaan kanta udara yang terhad, sebarang rendaman minyak tidak sesuai untuk suhu tinggi dan visualisasi melalui sampel lutsinar >1 mm tebal.Baru-baru ini, had ini telah ditarik balik oleh Charles-Orzag et al. 28, yang membangunkan peranti yang tidak lagi memberikan haba di sekeliling sistem yang diminati, tetapi di dalam kaca penutup itu sendiri, ditutup dengan lapisan telus nipis perintang yang diperbuat daripada ITO (indium-tin oksida). Tudung boleh dipanaskan sehingga 75 °C dengan mengalirkan arus elektrik melalui lapisan lutsinar. Walau bagaimanapun, pengarang juga mesti memanaskan kanta ke objektif, tetapi tidak melebihi 65 °C, supaya tidak merosakkannya.
Kerja-kerja ini menunjukkan bahawa pembangunan mikroskop optik suhu tinggi yang cekap belum diterima pakai secara meluas, sering memerlukan peralatan buatan sendiri, dan sering dicapai dengan kos resolusi spatial, yang merupakan kelemahan yang serius memandangkan mikroorganisma termofilik tidak lebih besar daripada beberapa. mikrometer. Isipadu pemanasan yang dikurangkan adalah kunci untuk menyelesaikan tiga masalah yang wujud dalam HTM: resolusi spatial yang lemah, inersia haba yang tinggi apabila sistem menjadi panas, dan pemanasan elemen sekeliling yang berbahaya (minyak rendaman, kanta objektif... atau tangan pengguna) pada suhu yang melampau. ).
Dalam makalah ini, kami memperkenalkan HTM untuk pemerhatian termofil yang tidak berdasarkan pemanasan rintangan. Sebaliknya, kami mencapai pemanasan setempat dalam kawasan terhad bidang pandangan mikroskop melalui penyinaran laser substrat yang menyerap cahaya. Pengagihan suhu telah divisualisasikan menggunakan mikroskop fasa kuantitatif (QPM). Keberkesanan kaedah ini ditunjukkan oleh Geobacillus stearothermophilus, bakteria termofilik motil yang membiak pada kira-kira 65°C dan mempunyai masa penggandaan yang singkat (kira-kira 20 minit), dan Sulfolobus shibatae, sejenis hyperthermophile yang tumbuh secara optimum pada 80°C (archaea) untuk menggambarkan. Kadar replikasi normal dan berenang diperhatikan sebagai fungsi suhu. Laser HTM (LA-HTM) ini tidak dihadkan oleh ketebalan coverlip atau oleh sifat objektif (rendaman udara atau minyak). Ini membolehkan mana-mana kanta resolusi tinggi di pasaran untuk digunakan. Ia juga tidak mengalami pemanasan perlahan akibat inersia haba (mencapai pemanasan segera pada skala milisaat) dan hanya menggunakan komponen yang tersedia secara komersial. Satu-satunya kebimbangan keselamatan baharu adalah berkaitan dengan kehadiran pancaran laser berkuasa (biasanya sehingga 100 mW) di dalam peranti dan mungkin melalui mata, yang memerlukan cermin mata pelindung.
Prinsip LA-HTM adalah menggunakan laser untuk memanaskan sampel secara tempatan dalam bidang pandangan mikroskop (Rajah 1a). Untuk melakukan ini, sampel mestilah menyerap cahaya. Untuk menggunakan kuasa laser yang munasabah (kurang daripada 100 mW), kami tidak bergantung pada penyerapan cahaya oleh medium cecair, tetapi secara buatan meningkatkan penyerapan sampel dengan menyalut substrat dengan nanopartikel emas (Rajah 1c). Pemanasan nanopartikel emas dengan cahaya adalah kepentingan asas kepada bidang plasmonik terma, dengan aplikasi yang dijangkakan dalam bioperubatan, nanokimia atau penuaian cahaya matahari29,30,31. Sejak beberapa tahun kebelakangan ini, kami telah menggunakan LA-HTM ini dalam beberapa kajian yang berkaitan dengan aplikasi plasma terma dalam fizik, kimia dan biologi. Kesukaran utama dengan kaedah ini adalah dalam memaparkan profil suhu akhir, kerana suhu tinggi adalah terhad kepada kawasan skala mikro dalam sampel. Kami telah menunjukkan bahawa pemetaan suhu boleh dicapai dengan interferometer ricih melintang empat gelombang, kaedah mikroskop fasa kuantitatif yang mudah, resolusi tinggi dan sangat sensitif berdasarkan penggunaan grating pembelauan dua dimensi (juga dikenali sebagai jeriji silang) 33,34,35,36. Kebolehpercayaan teknik mikroskop terma ini, berdasarkan mikroskop muka gelombang parut bersilang (CGM), telah ditunjukkan dalam sedozen kertas kerja yang diterbitkan sepanjang dekad yang lalu37,38,39,40,41,42,43.
Skim pemasangan pemanasan laser selari, membentuk dan mikroskop suhu. b Contoh geometri yang terdiri daripada ruang AttofluorTM yang mengandungi slip penutup yang disalut dengan nanozarah emas. c Lihat dengan teliti pada sampel (bukan skala). d mewakili profil pancaran laser seragam dan (e) simulasi pengedaran suhu seterusnya pada satah sampel nanozarah emas. f ialah profil pancaran laser anulus yang sesuai untuk menghasilkan suhu seragam seperti yang ditunjukkan dalam simulasi taburan suhu yang terhasil ditunjukkan dalam (g). Bar skala: 30 µm.
Khususnya, kami baru-baru ini mencapai pemanasan sel mamalia dengan LA-HTM dan CGM dan menjejaki tindak balas kejutan haba selular dalam julat 37-42°C, menunjukkan kebolehgunaan teknik ini kepada pengimejan sel hidup tunggal. Walau bagaimanapun, penggunaan LA-HTM untuk kajian mikroorganisma pada suhu tinggi tidak jelas, kerana ia memerlukan lebih berhati-hati berbanding dengan sel mamalia: pertama, memanaskan bahagian bawah medium dengan berpuluh-puluh darjah (bukan beberapa darjah) membawa kepada kecerunan suhu menegak yang kuat. boleh mencipta perolakan bendalir 44 yang, jika tidak melekat kuat pada substrat, boleh menyebabkan pergerakan yang tidak diingini dan pencampuran bakteria. Perolakan ini boleh dihapuskan dengan mengurangkan ketebalan lapisan cecair. Untuk tujuan ini, dalam semua eksperimen yang dibentangkan di bawah, ampaian bakteria diletakkan di antara dua penutup penutup kira-kira 15 µm tebal diletakkan di dalam cawan logam (AttofluorTM, Thermofisher, Rajah 1b, c). Pada dasarnya, perolakan boleh dielakkan jika ketebalan cecair lebih kecil daripada saiz rasuk laser pemanasan. Kedua, bekerja dalam geometri terhad sedemikian boleh melemaskan organisma aerobik (lihat Rajah S2). Masalah ini boleh dielakkan dengan menggunakan substrat yang telap kepada oksigen (atau mana-mana gas penting lain), dengan meninggalkan gelembung udara yang terperangkap di dalam penutup penutup, atau dengan menggerudi lubang pada penutup atas (lihat Rajah S1) 45 . Dalam kajian ini, kami memilih penyelesaian yang terakhir (Rajah 1b dan S1). Akhirnya, pemanasan laser tidak memberikan pengagihan suhu seragam. Walaupun pada keamatan pancaran laser yang sama (Rajah 1d), taburan suhu tidak seragam, sebaliknya menyerupai taburan Gaussian akibat resapan terma (Rajah 1e). Apabila matlamatnya adalah untuk mewujudkan suhu yang tepat dalam bidang pandangan untuk mengkaji sistem biologi, profil yang tidak sekata adalah tidak sesuai dan juga boleh menyebabkan pergerakan bakteria termoforesis jika ia tidak melekat pada substrat (lihat Rajah S3, S4)39. Untuk tujuan ini, kami menggunakan modulator cahaya spatial (SLM) untuk membentuk pancaran laser inframerah mengikut bentuk gelang (Rajah 1f) dalam satah sampel untuk mencapai taburan suhu seragam yang sempurna dalam kawasan geometri tertentu, walaupun resapan terma (Rajah 1d) 39 , 42, 46. Letakkan penutup atas di atas pinggan logam (Rajah 1b) untuk mengelakkan penyejatan medium dan perhatikan selama sekurang-kurangnya beberapa hari. Oleh kerana slip penutup atas ini tidak dimeterai, medium tambahan boleh ditambah dengan mudah pada bila-bila masa jika perlu.
Untuk menggambarkan cara LA-HTM berfungsi dan menunjukkan kebolehgunaannya dalam penyelidikan termofilik, kami mengkaji bakteria aerobik Geobacillus stearothermophilus, yang mempunyai suhu pertumbuhan optimum sekitar 60-65°C. Bakteria juga mempunyai flagela dan keupayaan untuk berenang, memberikan satu lagi penunjuk aktiviti selular yang normal.
Sampel (Rajah 1b) telah diinkubasi pada suhu 60°C selama satu jam dan kemudian diletakkan di dalam pemegang sampel LA-HTM. Pra-inkubasi ini adalah pilihan, tetapi masih berguna, atas dua sebab: Pertama, apabila laser dihidupkan, ia menyebabkan sel-sel tumbuh dan membahagi dengan serta-merta (lihat filem M1 dalam Bahan Tambahan). Tanpa pra-pengeraman, pertumbuhan bakteria biasanya ditangguhkan kira-kira 40 minit setiap kali kawasan tontonan baharu dipanaskan pada sampel. Kedua, pra-inkubasi selama 1 jam menggalakkan lekatan bakteria pada penutup, menghalang sel daripada hanyut keluar dari medan pandangan akibat termoforesis apabila laser dihidupkan (lihat filem M2 dalam Bahan Tambahan). Termoforesis ialah pergerakan zarah atau molekul sepanjang kecerunan suhu, biasanya dari panas ke sejuk, dan bakteria tidak terkecuali43,47. Kesan yang tidak diingini ini dihapuskan di kawasan tertentu dengan menggunakan SLM untuk membentuk pancaran laser dan mencapai taburan suhu rata.
Pada rajah. Rajah 2 menunjukkan taburan suhu yang diukur oleh CGM yang diperoleh dengan menyinari substrat kaca yang disalut dengan nanopartikel emas dengan pancaran laser anulus (Rajah 1f). Taburan suhu rata diperhatikan di seluruh kawasan yang diliputi oleh pancaran laser. Zon ini ditetapkan kepada 65°C, suhu pertumbuhan optimum. Di luar kawasan ini, lengkung suhu secara semula jadi jatuh ke \(1/r\) (di mana \(r\) ialah koordinat jejari).
Peta suhu pengukuran CGM yang diperoleh dengan menggunakan pancaran laser anulus untuk menyinari lapisan nanozarah emas untuk mendapatkan profil suhu rata di atas kawasan bulat. b Isoterma peta suhu (a). Kontur pancaran laser diwakili oleh bulatan bertitik kelabu. Percubaan diulang dua kali (lihat Bahan Tambahan, Rajah S4).
Daya maju sel bakteria dipantau selama beberapa jam menggunakan LA-HTM. Pada rajah. 3 menunjukkan selang masa untuk empat imej yang diambil daripada filem 3 jam 20 minit (Filem M3, Maklumat Tambahan). Bakteria diperhatikan secara aktif membiak dalam kawasan bulat yang ditentukan oleh laser di mana suhu optimum, menghampiri 65°C. Sebaliknya, pertumbuhan sel berkurangan dengan ketara apabila suhu jatuh di bawah 50°C selama 10 saat.
Imej kedalaman optik bakteria G. stearothermophilus yang tumbuh selepas pemanasan laser pada masa yang berbeza, (a) t = 0 min, (b) 1 h 10 min, (c) 2 h 20 min, (d) 3 h 20 min, daripada 200 Diekstrak daripada filem satu minit (filem M3 disediakan dalam Maklumat Tambahan) yang ditindih pada peta suhu yang sepadan. Laser dihidupkan pada masa \(t=0\). Isoterma telah ditambah pada imej keamatan.
Untuk mengukur lagi pertumbuhan sel dan pergantungannya pada suhu, kami mengukur peningkatan biojisim pelbagai koloni bakteria yang diasingkan pada mulanya dalam medan pandangan Filem M3 (Rajah 4). Bakteria induk yang dipilih pada permulaan pembentukan unit pembentuk koloni mini (mCFU) ditunjukkan dalam Rajah S6. Pengukuran jisim kering telah diambil dengan kamera CGM 48 yang digunakan untuk memetakan taburan suhu. Keupayaan CGM untuk mengukur berat kering dan suhu adalah kekuatan LA-HTM. Seperti yang dijangkakan, suhu tinggi menyebabkan pertumbuhan bakteria lebih cepat (Rajah 4a). Seperti yang ditunjukkan dalam plot separa log dalam Rajah 4b, pertumbuhan pada semua suhu mengikuti pertumbuhan eksponen, di mana data menggunakan fungsi eksponen \(m={m}_{0}{10}^{t/\ tau }+ {{ \mbox{cst}}}\), di mana \(\tau {{{{{\rm{log }}}}}}}2\) – masa penjanaan (atau masa penggandaan), \( g =1/ \tau\) – kadar pertumbuhan (bilangan pembahagian setiap unit masa ). Pada rajah. 4c menunjukkan kadar pertumbuhan dan masa penjanaan masing-masing sebagai fungsi suhu. MCFU yang berkembang pesat dicirikan oleh ketepuan pertumbuhan selepas dua jam, tingkah laku yang dijangkakan disebabkan oleh ketumpatan bakteria yang tinggi (serupa dengan fasa pegun dalam kultur cecair klasik). Bentuk umum \(g\left(T\right)\) (Gamb. 4c) sepadan dengan jangkaan lengkung dua fasa untuk G. stearothermophilus dengan kadar pertumbuhan optimum sekitar 60-65°C. Padankan data menggunakan model kardinal (Rajah S5)49 dengan \(\left({{G}_{0}{;\;T}}_{{\min }};{T}_{{opt} } ;{T}_{{\maks}}\kanan)\) = (0.70 ± 0.2; 40 ± 4; 65 ± 1.6; 67 ± 3) °C, yang sesuai dengan nilai lain yang disebut dalam literatur49. Walaupun parameter bergantung kepada suhu boleh dihasilkan semula, kadar pertumbuhan maksimum \({G}_{0}\) mungkin berbeza dari satu percubaan ke percubaan yang lain (lihat rajah S7-S9 dan filem M4). Berbeza dengan parameter pematuhan suhu, yang sepatutnya universal, kadar pertumbuhan maksimum bergantung pada sifat medium (ketersediaan nutrien, kepekatan oksigen) dalam geometri mikro yang diperhatikan.
a Pertumbuhan mikrob pada pelbagai suhu. mCFU: Unit Pembentuk Koloni Miniatur. Data diperoleh daripada video bakteria tunggal yang tumbuh dalam kecerunan suhu (filem M3). b Sama seperti (a), skala separa logaritma. c Kadar pertumbuhan\(\tau\) dan masa penjanaan\(g\) dikira daripada regresi linear (b). Bar ralat mendatar: julat suhu di mana mCFU berkembang ke dalam bidang pandangan semasa pertumbuhan. Bar ralat menegak: ralat piawai regresi linear.
Selain pertumbuhan normal, sesetengah bakteria kadangkala terapung ke pandangan semasa pemanasan laser, yang merupakan tingkah laku yang dijangkakan untuk bakteria dengan flagela. Filem M5 dalam maklumat tambahan menunjukkan aktiviti renang tersebut. Dalam eksperimen ini, sinaran laser seragam digunakan untuk mencipta kecerunan suhu, seperti yang ditunjukkan dalam Rajah 1d, e dan S3. Rajah 5 menunjukkan dua jujukan imej yang dipilih daripada filem M5 menunjukkan bahawa satu bakteria mempamerkan pergerakan arah manakala semua bakteria lain kekal tidak bergerak.
Dua rangka masa (a) dan (b) menunjukkan berenang dua bakteria berbeza yang ditandakan dengan bulatan bertitik. Imej-imej telah diekstrak daripada filem M5 (disediakan sebagai bahan tambahan).
Dalam kes G. stearothermophilus, pergerakan aktif bakteria (Rajah 5) bermula beberapa saat selepas pancaran laser dihidupkan. Pemerhatian ini menekankan tindak balas temporal mikroorganisma termofilik ini kepada peningkatan suhu, seperti yang telah diperhatikan oleh Mora et al. 24 . Topik motilitas bakteria dan juga termotaksis boleh diterokai dengan lebih lanjut menggunakan LA-HTM.
Renang mikrob tidak boleh dikelirukan dengan jenis gerakan fizikal yang lain, iaitu (i) Gerakan Brown, yang kelihatan seperti gerakan huru-hara tanpa arah yang pasti, (ii) perolakan 50 dan termoforesis 43, yang terdiri daripada hanyutan biasa sepanjang suhu. kecerunan.
G. stearothermophilus terkenal dengan keupayaannya menghasilkan spora yang sangat tahan (pembentukan spora) apabila terdedah kepada keadaan persekitaran yang buruk sebagai pertahanan. Apabila keadaan persekitaran menjadi baik semula, spora bercambah, membentuk sel hidup dan meneruskan pertumbuhan. Walaupun proses sporulasi/percambahan ini diketahui umum, ia tidak pernah diperhatikan dalam masa nyata. Menggunakan LA-HTM, kami melaporkan di sini pemerhatian pertama kejadian percambahan dalam G. stearothermophilus.
Pada rajah. 6a menunjukkan imej selang masa bagi kedalaman optik (OT) yang diperoleh menggunakan set CGM 13 spora. Untuk keseluruhan masa pengumpulan (15 h 6 min, \(t=0\) – permulaan pemanasan laser), 4 daripada 13 spora bercambah, pada titik masa berturut-turut \(t=2\) h, \( 3\ ) h \(10 \)', \(9\) h \(40\)' dan \(11\) h \(30\)'. Walaupun hanya satu daripada peristiwa ini ditunjukkan dalam Rajah 6, 4 peristiwa percambahan boleh diperhatikan dalam filem M6 dalam bahan tambahan. Menariknya, percambahan kelihatan rawak: tidak semua spora bercambah dan tidak bercambah pada masa yang sama, walaupun perubahan yang sama dalam keadaan persekitaran.
a Time-lapse yang terdiri daripada 8 imej OT (rendaman minyak, objektif 60x, 1.25 NA) dan (b) evolusi biojisim agregat G. stearothermophilus. c (b) Dilukis pada skala separa log untuk menyerlahkan kelinearan kadar pertumbuhan (garis putus-putus).
Pada rajah. 6b,c menunjukkan biojisim populasi sel dalam bidang pandangan sebagai fungsi masa sepanjang tempoh pengumpulan data. Pereputan cepat jisim kering diperhatikan pada \(t=5\)h dalam rajah. 6b, c, disebabkan keluarnya beberapa sel dari medan pandangan. Kadar pertumbuhan empat peristiwa ini ialah \(0.77\pm 0.1\) h-1. Nilai ini lebih tinggi daripada kadar pertumbuhan yang dikaitkan dengan Rajah 3. 3 dan 4, di mana sel tumbuh secara normal. Sebab peningkatan kadar pertumbuhan G. stearothermophilus daripada spora tidak jelas, tetapi ukuran ini menyerlahkan minat LA-HTM dan berfungsi pada tahap sel tunggal (atau pada tahap mCFU tunggal) untuk mengetahui lebih lanjut tentang dinamik kehidupan sel. .
Untuk menunjukkan lagi kepelbagaian LA-HTM dan prestasinya pada suhu tinggi, kami meneliti pertumbuhan Sulfolobus shibatae, archaea asidofilik hipertermofilik dengan suhu pertumbuhan optimum 80°C51. Berbanding dengan G. stearothermophilus, archaea ini juga mempunyai morfologi yang sangat berbeza, menyerupai 1 mikron sfera (cocci) dan bukannya batang memanjang (bacilli).
Rajah 7a terdiri daripada imej kedalaman optik berjujukan S. shibatae mCFU yang diperoleh menggunakan CGM (lihat filem ciri M7 dalam Bahan Tambahan). mCFU ini tumbuh pada sekitar 73°C, di bawah suhu optimum 80°C, tetapi dalam julat suhu untuk pertumbuhan aktif. Kami memerhatikan pelbagai peristiwa pembelahan yang menjadikan mCFU kelihatan seperti mikrograpes archaea selepas beberapa jam. Daripada imej OT ini, biojisim mCFU diukur dari masa ke masa dan dibentangkan dalam Rajah 7b. Menariknya, S. shibatae mCFUs menunjukkan pertumbuhan linear dan bukannya pertumbuhan eksponen yang dilihat dengan G. stearothermophilus mCFUs. Terdapat perbincangan lama 52 tentang sifat kadar pertumbuhan sel: sementara beberapa kajian melaporkan kadar pertumbuhan mikrob yang berkadar dengan saiznya (pertumbuhan eksponen), yang lain menunjukkan kadar yang tetap (pertumbuhan linear atau bilinear). Seperti yang dijelaskan oleh Tzur et al.53, membezakan antara pertumbuhan eksponen dan (bi) linear memerlukan ketepatan <6% dalam pengukuran biojisim, yang tidak dapat dicapai oleh kebanyakan teknik QPM, malah melibatkan interferometri. Seperti yang dijelaskan oleh Tzur et al.53, membezakan antara pertumbuhan eksponen dan (bi) linear memerlukan ketepatan <6% dalam pengukuran biojisim, yang tidak dapat dicapai oleh kebanyakan teknik QPM, malah melibatkan interferometri. Как объяснили Цур и др.53, различение экспоненциального и (би)линейного роста требует точности <6% в избеиостих для большинства методов QPM, даже с использованием интерферометрии. Seperti yang dijelaskan oleh Zur et al.53, membezakan antara pertumbuhan eksponen dan (bi) linear memerlukan ketepatan <6% dalam pengukuran biojisim, yang tidak boleh dicapai untuk kebanyakan kaedah QPM, walaupun menggunakan interferometri.Seperti yang dijelaskan oleh Zur et al. 53, membezakan antara pertumbuhan eksponen dan (bi) linear memerlukan kurang daripada 6% ketepatan dalam pengukuran biojisim, yang tidak boleh dicapai untuk kebanyakan kaedah QPM, walaupun apabila interferometri digunakan. CGM mencapai ketepatan ini dengan ketepatan sub-pg dalam ukuran biojisim36,48.
a Time-lapse yang terdiri daripada 6 imej OT (rendaman minyak, 60x, objektif NA 1.25) dan (b) evolusi biojisim mikro-CFU yang diukur dengan CGM. Lihat filem M7 untuk maklumat lanjut.
Pertumbuhan linear sempurna S. shibatae adalah tidak dijangka dan masih belum dilaporkan. Walau bagaimanapun, pertumbuhan eksponen dijangka, sekurang-kurangnya kerana dari semasa ke semasa, berbilang pembahagian 2, 4, 8, 16 … sel mesti berlaku. Kami membuat hipotesis bahawa pertumbuhan linear mungkin disebabkan oleh perencatan sel akibat pembungkusan sel yang padat, sama seperti pertumbuhan sel menjadi perlahan dan akhirnya mencapai keadaan tidak aktif apabila ketumpatan sel terlalu tinggi.
Kami menyimpulkan dengan membincangkan lima perkara menarik berikut secara bergilir: pengurangan dalam isipadu pemanasan, pengurangan inersia haba, minat dalam nanozarah emas, minat dalam mikroskop fasa kuantitatif, dan julat suhu yang mungkin di mana LA-HTM boleh digunakan.
Berbanding dengan pemanasan rintangan, pemanasan laser yang digunakan untuk pembangunan HTM menawarkan beberapa kelebihan, yang kami gambarkan dalam kajian ini. Khususnya, dalam media cecair dalam bidang pandangan mikroskop, isipadu pemanasan disimpan dalam beberapa (10 μm) 3 jilid. Dengan cara ini, hanya mikrob yang diperhatikan yang aktif, manakala bakteria lain tidak aktif dan boleh digunakan untuk mengkaji lebih lanjut sampel - tidak perlu menukar sampel setiap kali suhu baharu perlu diperiksa. Di samping itu, pemanasan skala mikro membolehkan pemeriksaan terus julat suhu yang besar: Rajah 4c diperoleh daripada filem 3 jam (Filem M3), yang biasanya memerlukan penyediaan dan pemeriksaan beberapa sampel - satu untuk setiap sampel yang dikaji. y ialah suhu yang mewakili bilangan hari dalam eksperimen. Mengurangkan isipadu yang dipanaskan juga memastikan semua komponen optik di sekeliling mikroskop, terutamanya kanta objektif, pada suhu bilik, yang menjadi masalah utama yang dihadapi oleh masyarakat setakat ini. LA-HTM boleh digunakan dengan mana-mana kanta, termasuk kanta rendaman minyak, dan akan kekal pada suhu bilik walaupun dengan suhu yang melampau dalam bidang pandangan. Batasan utama kaedah pemanasan laser yang kami laporkan dalam kajian ini ialah sel yang tidak melekat atau terapung mungkin jauh dari bidang pandangan dan sukar untuk dikaji. Penyelesaian mungkin menggunakan kanta pembesaran rendah untuk mencapai kenaikan suhu yang lebih besar melebihi beberapa ratus mikron. Awas ini disertai dengan penurunan dalam resolusi spatial, tetapi jika matlamatnya adalah untuk mengkaji pergerakan mikroorganisma, resolusi spatial yang tinggi tidak diperlukan.
Skala masa untuk memanaskan (dan menyejukkan) sistem \({{{{{\rm{\tau }}}}}}}}}_{{{\mbox{D}}}}\) bergantung pada saiznya , mengikut undang-undang \({{{({\rm{\tau }}}}}}}}_{{{\mbox{D}}}}={L}^{2}/D\), di mana \ (L\ ) ialah saiz ciri sumber haba (diameter pancaran laser dalam kajian kami ialah \(L\ kira-kira 100\) μm), \(D\) ialah keresapan terma persekitaran (purata dalam kes, kaca dan air Kadar resapan\(D\ kira-kira 2\kali ganda {10}^{-7}\) m2/s Oleh itu, dalam kajian ini, tindak balas masa tertib 50 ms, iaitu separa-semerta). perubahan suhu, boleh dijangkakan kenaikan suhu serta-merta ini bukan sahaja memendekkan tempoh percubaan, tetapi juga membenarkan pemasaan yang tepat \(t=0\) untuk sebarang kajian dinamik kesan suhu.
Kaedah cadangan kami boleh digunakan untuk mana-mana substrat yang menyerap cahaya (contohnya, sampel komersial dengan salutan ITO). Walau bagaimanapun, nanopartikel emas mampu memberikan penyerapan yang tinggi dalam inframerah dan penyerapan rendah dalam julat yang boleh dilihat, ciri-ciri terakhir yang menarik untuk pemerhatian optik yang berkesan dalam julat yang boleh dilihat, terutamanya apabila menggunakan pendarfluor. Di samping itu, emas adalah biokompatibel, lengai secara kimia, ketumpatan optik boleh dilaraskan daripada 530 nm kepada inframerah dekat, dan penyediaan sampel adalah mudah dan menjimatkan29.
Mikroskopi hadapan gelombang parut melintang (CGM) membenarkan bukan sahaja pemetaan suhu pada skala mikro, tetapi juga pemantauan biojisim, menjadikannya amat berguna (jika tidak perlu) dalam kombinasi dengan LA-HTM. Sepanjang dekad yang lalu, teknik mikroskop suhu lain telah dibangunkan, terutamanya dalam bidang bioimaging, dan kebanyakannya memerlukan penggunaan probe pendarfluor sensitif suhu54,55. Walau bagaimanapun, kaedah ini telah dikritik dan beberapa laporan telah mengukur perubahan suhu yang tidak realistik dalam sel, mungkin disebabkan oleh fakta bahawa pendarfluor bergantung kepada banyak faktor selain daripada suhu. Di samping itu, kebanyakan probe pendarfluor tidak stabil pada suhu tinggi. Oleh itu, QPM dan khususnya CGM mewakili teknik mikroskop suhu yang ideal untuk mengkaji kehidupan pada suhu tinggi menggunakan mikroskop optik.
Kajian S. shibatae, yang hidup secara optimum pada 80°C, menunjukkan bahawa LA-HTM boleh digunakan untuk mengkaji hipertermofil, bukan hanya termofil mudah. Pada dasarnya, tiada had kepada julat suhu yang boleh dicapai menggunakan LA-HTM, malah suhu melebihi 100°C boleh dicapai pada tekanan atmosfera tanpa mendidih, seperti yang ditunjukkan oleh kumpulan 38 kami dalam aplikasi kimia hidroterma di atmosfera tekanan A. Laser digunakan untuk memanaskan nanopartikel emas 40 dengan cara yang sama. Oleh itu, LA-HTM mempunyai potensi untuk digunakan untuk memerhati hipertermofil yang belum pernah terjadi sebelumnya dengan mikroskop optik resolusi tinggi standard di bawah keadaan standard (iaitu di bawah tekanan persekitaran).
Semua eksperimen dilakukan menggunakan mikroskop buatan sendiri, termasuk pencahayaan Köhler (dengan LED, M625L3, Thorlabs, 700 mW), pemegang spesimen dengan pergerakan xy manual, objektif (Olympus, 60x, 0.7 NA, udara, LUCPlanFLN60X atau 60x, 1.25 NA, Minyak , UPLFLN60XOI), kamera CGM (parut silang QLSI, pic 39 µm, 0.87 mm dari sensor kamera Andor Zyla) untuk memberikan keamatan dan pengimejan hadapan gelombang, dan kamera sCMOS (ORCA Flash 4.0 V3, mod 16-bit , dari Hamamatsu) untuk merakam data yang ditunjukkan dalam Rajah 5 (berenang bakteria). Pembahagi rasuk dichroic ialah tepi BrightLine 749 nm (Semrock, FF749-SDi01). Penapis di bahagian hadapan kamera ialah penapis laluan pendek 694 (FF02-694/SP-25, Semrock). Laser nilam titanium (Laser Verdi G10, 532 nm, 10 W, rongga laser tsunami yang dipam, Spectra-Physics dalam Rajah 2-5, digantikan lagi dengan laser Millenia, Spectraphysics 10 W, rongga laser Mira yang dipam, Koheren, untuk Rajah 2 -5). 6 dan 7) ditetapkan kepada panjang gelombang \({{{({\rm{\lambda }}}}}}=800\) nm, yang sepadan dengan spektrum resonans plasmon nanozarah emas. Modulator cahaya spatial (1920 × 1152 piksel) telah dibeli daripada Meadowlark Optik Hologram dikira menggunakan algoritma Gerchberg-Saxton seperti yang diterangkan dalam pautan 39.
Cross grating wavefront microscopy (CGM) ialah teknik mikroskop optik berdasarkan gabungan grating difraksi dua dimensi (juga dikenali sebagai cross grating) pada jarak satu milimeter dari sensor kamera konvensional. Contoh CGM yang paling biasa yang telah kami gunakan dalam kajian ini dipanggil interferometer anjakan melintang empat gelombang (QLSI), di mana jeriji silang terdiri daripada corak papan dam intensiti/fasa yang diperkenalkan dan dipatenkan oleh Primot et al. pada tahun 200034. Garisan parut menegak dan mendatar mencipta bayang-bayang seperti grid pada penderia, herotan yang boleh diproses secara berangka dalam masa nyata untuk mendapatkan herotan muka gelombang optik (atau profil fasa setara) cahaya kejadian. Apabila digunakan pada mikroskop, kamera CGM boleh memaparkan perbezaan laluan optik objek yang diimej, juga dikenali sebagai kedalaman optik (OT), dengan kepekaan pada susunan nanometer36. Dalam mana-mana ukuran CGM, untuk menghapuskan sebarang kecacatan pada komponen optik atau rasuk, imej OT rujukan utama mesti diambil dan ditolak daripada mana-mana imej berikutnya.
Mikroskopi suhu dilakukan menggunakan kamera CGM seperti yang diterangkan dalam rujukan. 32. Ringkasnya, memanaskan cecair mengubah indeks biasannya, mewujudkan kesan kanta haba yang memesongkan pancaran kejadian. Herotan muka gelombang ini diukur oleh CGM dan diproses menggunakan algoritma penyahkonvolusi untuk mendapatkan taburan suhu tiga dimensi dalam medium cecair. Jika nanozarah emas diagihkan sama rata di seluruh sampel, pemetaan suhu boleh dilakukan di kawasan bebas bakteria untuk menghasilkan imej yang lebih baik, yang kadang-kadang kita lakukan. Imej CGM rujukan diperoleh tanpa pemanasan (dengan laser dimatikan) dan kemudiannya ditangkap di lokasi yang sama dalam imej dengan laser dihidupkan.
Pengukuran jisim kering dicapai menggunakan kamera CGM yang sama yang digunakan untuk pengimejan suhu. Imej rujukan CGM diperoleh dengan menggerakkan sampel dengan pantas dalam x dan y semasa pendedahan sebagai cara untuk merata-rata sebarang ketidakhomogenan dalam OT disebabkan oleh kehadiran bakteria. Daripada imej OT bakteria, biojisim mereka diperoleh menggunakan ensemble imej di atas kawasan yang dipilih menggunakan algoritma segmentasi buatan sendiri Matlab (lihat subseksyen "Kod berangka"), mengikut prosedur yang diterangkan dalam ref. 48. Ringkasnya, kami menggunakan hubungan \(m={\alpha}^{-1}\iint {{\mbox{OT}}}\left(x,y\right){{\mbox{d}} } x{{\mbox{d}}}y\), dengan \({{\mbox{OT}}}\left(x,y\right)\) ialah imej kedalaman optik, \(m\) ialah berat kering dan \({{{{\rm{\alpha }}}}}}}\) ialah pemalar. Kami memilih \({{{{\rm{\alpha))))))=0.18\) µm3/pg, yang merupakan pemalar biasa untuk sel hidup.
Slip penutup berdiameter 25 mm dan tebal 150 µm bersalut nanozarah emas diletakkan ke dalam ruang AttofluorTM (Thermofisher) dengan zarah nano emas menghadap ke atas. Geobacillus stearothermophilus telah diprakultur semalaman dalam medium LB (200 rpm, 60°C) sebelum setiap hari eksperimen. Titisan 5 µl ampaian G. stearothermophilus dengan ketumpatan optik (OD) 0.3 hingga 0.5 diletakkan pada slip penutup dengan nanozarah emas. Kemudian, slip penutup bulat berdiameter 18 mm dengan lubang diameter 5 mm di tengah dijatuhkan ke atas titisan, dan 5 μl ampaian bakteria dengan ketumpatan optik yang sama telah berulang kali digunakan pada bahagian tengah lubang. Telaga pada slip penutup disediakan mengikut prosedur yang diterangkan dalam rujukan. 45 (lihat Maklumat Tambahan untuk maklumat lanjut). Kemudian tambah 1 ml medium LB ke dalam penutup untuk mengelakkan lapisan cecair daripada kering. Slip penutup terakhir diletakkan di atas penutup tertutup ruang Attofluor™ untuk mengelakkan penyejatan medium semasa pengeraman. Untuk eksperimen percambahan, kami menggunakan spora, yang, selepas eksperimen konvensional, kadangkala menutup penutup atas. Kaedah yang sama digunakan untuk mendapatkan Sulfolobus shibatae. Tiga hari (200 rpm, 75°C) penanaman awal Thiobacillus serrata telah dijalankan dalam medium 182 (DSMZ).
Sampel nanopartikel emas telah disediakan oleh litografi kopolimer blok misel. Proses ini diterangkan secara terperinci dalam Bab. 60. Secara ringkas, misel yang membungkus ion emas telah disintesis dengan mencampurkan kopolimer dengan HAuCl4 dalam toluena. Slip penutup yang telah dibersihkan kemudiannya direndam dalam larutan dan dirawat dengan penyinaran UV dengan kehadiran agen pengurangan untuk mendapatkan biji emas. Akhirnya, benih emas ditanam dengan menghubungi penutup penutup dengan larutan berair KAuCl4 dan etanolamin selama 16 minit, yang menghasilkan susunan kuasi-berkala dan sangat seragam nanozarah emas bukan sfera dalam inframerah dekat.
Untuk menukar interferogram kepada imej OT, kami menggunakan algoritma buatan sendiri, seperti yang diperincikan dalam pautan. 33 dan tersedia sebagai pakej Matlab dalam repositori awam berikut: https://github.com/baffou/CGMprocess. Pakej boleh mengira keamatan dan imej OT berdasarkan interferogram yang dirakam (termasuk imej rujukan) dan jarak tatasusunan kamera.
Untuk mengira corak fasa yang digunakan pada SLM untuk mendapatkan profil suhu tertentu, kami menggunakan algoritma buatan sendiri yang dibangunkan sebelum ini39,42 yang tersedia dalam repositori awam berikut: https://github.com/baffou/SLM_temperatureShaping. Input ialah medan suhu yang diingini, yang boleh ditetapkan secara digital atau melalui imej bmp monokrom.
Untuk membahagikan sel dan mengukur berat keringnya, kami menggunakan algoritma Matlab kami yang diterbitkan dalam repositori awam berikut: https://github.com/baffou/CGM_magicWandSegmentation. Pada setiap imej, pengguna mesti mengklik pada bakteria atau mCFU yang diminati, melaraskan sensitiviti tongkat dan mengesahkan pemilihan.
Untuk maklumat lanjut tentang reka bentuk kajian, lihat abstrak Laporan Penyelidikan Alam yang dipautkan kepada artikel ini.
Data yang menyokong hasil kajian ini boleh didapati daripada penulis masing-masing atas permintaan yang munasabah.
Kod sumber yang digunakan dalam kajian ini diperincikan dalam bahagian Kaedah, dan versi nyahpepijat boleh dimuat turun dari https://github.com/baffou/ dalam repositori berikut: SLM_temperatureShaping, CGMprocess dan CGM_magicWandSegmentation.
Mehta, R., Singhal, P., Singh, H., Damle, D. & Sharma, AK Insight into thermophiles dan aplikasi spektrum luas mereka. Mehta, R., Singhal, P., Singh, H., Damle, D. & Sharma, AK Insight into thermophiles dan aplikasi spektrum luas mereka.Mehta, R., Singhal, P., Singh, H., Damle, D. dan Sharma, AK Gambaran Keseluruhan termofil dan aplikasi luasnya. Mehta, R., Singhal, P., Singh, H., Damle, D. & Sharma, AK 深入了解嗜热菌及其广谱应用。 Mehta, R., Singhal, P., Singh, H., Damle, D. & Sharma, AK.Mehta R., Singhal P., Singh H., Damle D. dan Sharma AK Pemahaman mendalam tentang termofil dan pelbagai aplikasi.3 Bioteknologi 6, 81 (2016).
Masa siaran: Sep-26-2022